ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2009,25(2)
文章编号:1007-8738(2009)02-0150-05
Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定
1,2344
申咏梅*,杨晓春,董宁征,白 霞(苏州大学附属第二医院:1放免中心,2检验教研室,3磁共振室,江苏苏州
215004;
4
江苏省血液研究所,苏州大学附属第一医院,江苏苏州215006)
domains(VL)88%-95%homologouswithrespectivemu-rinegermlinegenesinGenBank.Furthermore,solubleFabantibodiesofthepositiveclonesweresuccessfullyex-pressedinE.coliXL1-BlueandthereactivitywiththemembraneproteinsofDaudicellswasdemonstratedbyWesternblo.tCONCLUSION:Fabphageantibodylibraryissuccessfullyconstructedandspecificantibodiesagainst
2
Generation,screeningandpreliminary
identificationofspecificFabphagean-tibodylibraryagainstDaudicellstrain
1,23SHENYong-mei*,YANGXiao-chun,DONGNing-
zheng,BAIXia
13
44
RadioimmunoassayCenter,DepartmentofClinicalLaboratory,
4
membraneantigensinDaudicellsareobtained,whichpro-videsanexpermientalfoundationforthefurtherinvestigationofB-lymphomamimunotherapy.[Keywords]
B-lymphoma;Fab;Phageantibodylibrary;Daudicellstrain;pComb3H-SSvector
[摘要] 目的:构建针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定。方法:以Daudi细胞免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗血清滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取RNA。利用RT-PCR扩增抗体¼轻链和重链Fd片段,经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS的相应酶切位点,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Daudi细胞为抗原对抗体库进行6轮/吸附-洗脱-扩增0筛选,并通过ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,获得的阳性克隆进一步做DNA序列测定、在大肠杆菌XL1-Blue中进行可溶性表达,并用Westernblot对表达产物的特异性作了鉴定。结果:构建了容量为3.13@107的抗人B细胞淋巴瘤Daudi细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Daudi细胞系特异性识别结合的4株阳性克隆。氨基酸序列分析结果显示:阳性克隆的重链、轻链可变区序列分别与基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链、轻链可变区序列有80%~94%和88%~95%同源性。阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达,Westernblot结果表明所获得的可溶性表达产物可与Daudi细胞膜抗原特异性结合。结论:成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Daudi细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。
[关键词]B细胞淋巴瘤;Fab;噬菌体抗体库;Daudi细胞
系;pComb3H-SS载体
[中图分类号]Q782 [文献标识码]A
DepartmentofMagneticResonance,SecondAffiliatedHospita,l
JiangsuInstitutieofHema-Suzhou
FirstAffiliatedHospita,l
SoochowUniversity,
SoochowUniversity,Suzhou215004;tology,215006,China
[Abstract] AIM:Togenerateandscreenthespecific
FabphageantibodylibraryagainsthumanDaudicellstraininB-lymphomaandidentifythepositiveclones.METH-ODS:BALB/cmiceweremimunizedwithDaudicells,andantiseraweretitratedbyELISA.Followingthedemonstra-tionofsufficientantibodytiter,totalRNAwasextractedfromspleniclymphocytesofthemimunizedmiceandRT-PCRwasusedtoamplifyJlightchainandFdfragmentsofheavychain.AfterrestrictivedigestionwithSacI/XbaIandXhoI/Spe,ItheJlightchainandtheFdfragmentsweresucces-sivelyinsertedintothephagemidvectorpComb3H-SSandthenelectroporatedintoE.coliXL1-Blue.ThespecificFabphageantibodylibraryagainstDaudicellstraininhumanB-ympholmawasconstructedbyinfectionofhelperphageVC-SM13.FollowingsixroundsofbiopanningwithDaudicells,theantigenbindingactivitiesofrandomclonesweretestedbyELISAtoselectthepositiveclones,whichwerefurtherDNAsequenced,expressedinE.coliXL1-Blueandident-ifiedbyWesternblo.tRESULTS:TheFabphageantibodyl-ibrarywith3.13@10sizewasconstructedandfourpositivecloneswhichspecificallyrecognizedDaudicellstrainwere-isolated.Inaminoacidsequences,thevariableheavydo-mains(VH)werefoundtobe80%-94%andvariablelight
收稿日期:2008-06-30; 接受日期:2008-09-08
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30400111);江苏省自然科学
基金资助项目(BK2004041)
作者简介:申咏梅(1969-),女,重庆人,副教授,医学博士
Te:l0512-67783445;E-mai:lszsym@yahoo.com.cn
7
恶性淋巴瘤是血液系统常见的恶性肿瘤,传统的治疗主要包括放疗、化疗及施行骨髓移植或外周血干细胞移植,但效果都不十分理想。目前,未标记*CorrespondingauthorISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2009,25(2)
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的单克隆抗体(mAb)以及放射性核素标记的mAb在B细胞淋巴瘤免疫治疗中已获得了令人鼓舞的疗[1,2]效,但其本身也存在一些缺陷:¹mAb多数是由淋巴瘤细胞免疫小鼠后经传统的杂交瘤技术制备而得,而传统杂交瘤技术制备的mAb存在杂交瘤细胞不稳定、低效等缺点,使得mAb来源极为有限;º用于核素标记的mAb大部分是鼠源性,当用于人体,特别是分割剂量反复使用时,可引起人抗鼠反应(HAMA)反应。尽管HAMA反应本身毒副作用不是很强,但它可改变mAb药物在体内的分布,在某种程度上抑制了抗体与肿瘤细胞的结合,降低了治疗效果。»人鼠嵌合型mAb虽然降低了HAMA反应发生的机率,但由于完整的抗体是大分子物质,很难透过肿瘤周围的毛细血管和间质进入肿瘤组织内部,致使抗体在肿瘤部位聚集量低,达不到理想的治疗浓度。噬菌体抗体库技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体,不经细胞融合,可制备出针对任何抗原的抗体分子,利用该技术制备的多为小分子抗体片段,相对分子质量(Mr)小、穿透性强、抗原性低、易于携带放射性核素或细胞毒性药物,进行导向诊断
[4,5]
和治疗。本研究以人B细胞淋巴瘤Daudi细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞RNA出发,用基因克隆技术将B细胞全套¼轻链和重链Fd片段基因克隆出来,组装到表达载体pComb3H-SS内并表达到噬菌体表面,构建出Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Daudi细胞为抗原对抗体库筛选后,获得针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系膜抗原的抗体。1 材料和方法
1.1 材料 pComb3H-SS质粒、宿主菌XL1-Blue和辅助噬菌体VCSM13由江苏省血液研究所提供。宿主菌XL1-Blue含有四环素(Tet)抗性基因。辅助噬菌体VCSM13含抗卡那霉素(Kana)抗性基因,滴度1B8@1012,自行培养扩增后4e保存。Daudi细胞、胰腺癌Patu8988细胞株和肺癌A549细胞株由本室保存。TRIzol为GibcoBRL公司产品;SacI、XbaI、XhoI、SpeI等限制性内切酶为Biolab公司产品;T4DNA连接酶及质粒抽提试剂盒为Promega公司产品;M-MLV第1链cDNA合成试剂盒为Fermentas公司产品;胶回收试剂盒为Qiagen公司产品;酶标二抗为Sigma公司产品;TMB底物溶液为TIANGEN公司产品。引物由美国Scripps研究所设计,上海生工公司合成。1.2 方法
1.2.1 动物免疫及脾淋巴细胞总RNA的提取 用2@10/L的Daudi细胞与等体积的福氏完全佐剂充分乳化后免疫6周龄BALB/c小鼠4只,4周后改用福氏不完全佐剂进行第2次免疫,第8周以8@10/L细胞加强免疫,加强免疫后3d从
10
10
眼眶取血,用ELISA法检测免疫效果。取免疫后血清滴度较高的2只小鼠处死,迅速取脾分离淋巴细胞,以TRIzol试剂提取细胞总RNA(按说明书操作),并测定总RNA的A260和A280值以计算含量和纯度。
1.2.2 重链Fd基因和轻链¼基因的RT-PCR扩增 以总RNA为模板,OligodT(18)为引物,在逆转录酶M-MLV的催化下合成cDNA第1链,再以cDNA为模板,利用特异性引物进行PCR扩增重链Fd和轻链¼基因。扩增条件为:94e预变性5min,然后94e
1min,50e30s,72e90s,共35个
循环,72e延伸10min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳分析,采用QIAEXII胶回收Kit回收目的片段。
1.2.3 Fab噬菌体抗体库的构建 将载体pComb3H-SS与PCR扩增获得的轻链¼基因分别经SacI/XbaI双酶切,琼脂糖凝胶电泳分离、纯化后,以T4DNA连接酶连接,并电转化感受态XL1-Blue细菌。将转化菌加入到2mLSOC培养基中,于37e振荡培养1h,再加入10mLSB培养基(含20mg/LAmp和10mg/LTet)于37e振荡培养1h,随后补加Amp至50mg/L于37e振荡培养过夜,提取质粒,即获得轻链¼基因文库。将轻链¼基因文库质粒和PCR扩增的重链Fd基因,分别以XhoI/SpeI双酶切、纯化、连接及电转化感受态XL1-Blue细菌。将其加入1mLSOC培养基,于37e振荡培养1h,此后加入10mLSB培养基(含20mg/LAmp和10mg/LTet),于37e振荡培养1h后补加Amp至50mg/L,继续摇菌1h。加入100mLSB(含50mg/LAmp及10mg/LTet)培养基和1012pfu的辅助噬菌体VCSM13,于37e振荡培养2h,再加入Kana至70mg/L于37e振荡培养过夜。次日在离心后的上清中加入40g/LPEG8000和30g/LNaCl沉淀噬菌体,将沉淀悬浮于2mL10g/LBSA-TBS中,离心收集上清即为Fab噬菌体抗体库(图1)。
[3]
图1 Fab基因在噬菌体质粒pComb3H-SS的插入位点Fig1
InsertionsiteofFabgenesonpComb3H-SSphagemid
1.2.4 抗体库的鉴定和滴度测定 取1LL抗体库以1B1000等比稀释,铺LB板(含Amp50mg/L,Tet20mg/L)于37e培养过夜,计数细菌集落,计算抗体库滴度。挑取单个菌落,分别培养及提取质粒,以SacI/XbaI、XhoI/SpeI及SacI/SpeI酶切,鉴定轻链J基因、重链Fd基因及Fab基因的插入率。1.2.5 噬菌体抗体库的富集筛选 分别以5@106、2.5@106、5@105、2.5@105、5@104、2.5@104Daudi细胞包被6孔板,20g/LBSA-PBS封闭4e过夜。加入1mL/孔Fab噬菌体抗体库,37e孵育2h,用适量5mL/LTBS/Tween-20洗板(第1轮洗1次,第2轮洗5次,第3、4轮各洗10次,第5、6轮各洗15次)。每孔加入1mL0.1mol/LHCl(用甘氨酸调pH值至2.2,含1g/LBSA)以洗脱噬菌体,室温静置10min,稍吹打后加入2mol/LTris中和。用此洗脱液感染2mL新鲜制备152
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的XL1-Blue,经辅助噬菌体VCSM13感染后进行下一轮的筛选。共进行6轮筛选,每轮筛选后均测定次级库的滴度,计算噬菌体抗体的投入产出比(回收率),作为特异性噬菌体抗体富集的指标。
1.2.6 单克隆噬菌体抗体的制备、鉴定及序列测定
(1)以
第6轮筛选回收的噬菌体感染新鲜制备的X-lBlue菌并铺板,37e培养过夜,随机挑取45个单菌落,分别加入到2mLSB培养基中,再加入滴度为1012pfu的辅助噬菌体VCSM13,振荡培养过夜后按抗体库制备法制备单克隆噬菌体抗体。(2)单克隆噬菌体抗体与Daudi细胞特异性反应的细胞ELISA检测:以Daudi细胞包被96孔板,每孔加入100LL单克隆噬菌体抗体作为一抗,37e孵育1.5h,0.5mL/LTween20-PBS洗孔3次,加入新鲜稀释的HRP连接的抗M13抗体为二抗(1B5000稀释)于各反应孔中,37e孵育1.5h,洗孔10次后于各反应孔中加入TMB底物显色15~30min,3mol/LH2SO4终止反应,用自动酶联仪于波长450nm检测A值。同时以空噬菌体液作为阴性对照,以大于3倍阴性对照判为阳性克隆。显色阳性的克隆再以胰腺癌细胞Patu8988、肺癌细胞A549、BSA等为抗原包被96孔板,鉴定抗原抗体反应的特异性。(3)筛选出来的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。轻链测序上游引物:5c-GGAATTGTGAGCG-GATAA-3c,下游引物:引物:
5c-CAGCGAGTAATAACAATCCAG-3c;
重链Fd测序上游引物:5c-AGCCGCTGGATTGTTATT-3c,下游
5c-GAACCGCCTCCCTCAGA-3c。用NCBIBLAST中的
Nucleotide-nucleotideBAST和ImmunoglobulinBLAST分析软件,对所获得的基因测序与GenBankIg基因库已知序列进行同源性分析。
1.2.7 Fab抗体的可溶性表达 经上述富集筛选后的阳性克隆,经30e培养过夜后提取质粒,用SpeI/NheI酶切质粒,除去噬菌体的gIII片段,自身环化后转化XL1-Blue;挑取单个菌落(XhoI/NotI酶切鉴定gIII是否被切除),接种于10mLSB(含50mg/LAmp,10mg/LTet,20mmol/LMgCl2),37e振荡培养6h后,加入IPTG诱导至终浓度为1mmol/L,30e振荡培养过夜。次日,4000r/min4e离心15min。回收上清于4e储存,同时用1mLPBS重悬细菌沉淀,于-70e冻结,再放于37e水浴溶解,如此重复4次,12000r/min4e离心15min,上清即含有表达的可溶性Fab抗体。
1.2.8 Westernblot分析 在Bio-Rab电转仪上将120g/LSDS-PAGE分离的Daudi细胞膜蛋白转移至醋酸纤维膜上,100g/L脱脂奶粉室温封闭30min后,加阳性克隆的可溶性Fab抗体4e过夜,TBST洗涤后加HRP标记的羊抗鼠Fab抗体,室温1.5h,最后加ECL底物避光显色。
图3 PCR扩增重链Fd片段和轻链J基因结果
Fig3 AmplificationoftheheavychainFdfragmentsandthelightchainJbyPCR
M:100bpDNAmarker;1:MixedFdfragmentsofheavychainsIgG1;2:MixedFdfragmentsofheavychainsIgG2a;3:MixedFdfragmentsofheavychainsIgG3;4:MixedlightchainJ.
图2 Daudi细胞免疫BALB/c小鼠的血清ELISA测定Fig2 ThetitersfortheantiserafromBALB/cmiceimmunizedwithDaudicellswereanalyzedbyELISA
2.2 抗体Fd段和轻链J基因的扩增 从Daudi细胞免疫效果较好的2只BALB/c小鼠脾脏分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA后,用一组鼠IgGFab基因引物,PCR扩增鼠IgG重链Fd基因和轻链J基因。用15g/L琼脂糖凝胶电泳显示,各亚类IgG的Fd基因和轻链J基因,均可扩增出大小约680bp的条带,与推测的Fd及轻链J基因的大小相符(图3)。
2.3 Fab噬菌体抗体库的构建及鉴定 将7对J链基因扩增片段混合、酶切、纯化及与线状载体pComb3H-SS连接后,电转化XL1-Blue菌中,构建J链基因文库。铺板测定库容为3.8@107。随机挑取9个克隆进行SacI/XbaI酶切鉴定,7个克隆可切出680bp左右的片段(图4),重组率为77.8%,实际J链基因库容量为2.96@107。将J链基因文库扩增并抽提质粒,经XhoI/SpeI酶切、纯化后,与经相同处理后的重链Fd段混合、连接、电转化XL1-Blue菌,构建J+Fd基因文库。铺板测定其库容为4.7@107,随机挑取9个克隆进行SacI/SpeI酶切鉴定,6个能切出1500bp左右的片段(图5),即既有重链Fd段又有轻链J基因的重组效率为66.7%,实际Fab基因库容量为4.7@107@66.7%=3.13@107。2.4 亲和筛选 以Daudi细胞为固相抗原对噬菌体抗体库进行6轮/吸附-洗脱-扩增0的富集筛选,将洗脱下来的噬菌体数量列入表1,计算产出率(yield%)。从表中可看出,随着多轮筛选,虽包被的Daudi细胞数量减少,洗板次数增多,但
2 结果
2.1 Daudi细胞免疫效果鉴定 小鼠经3次免疫后第3天,从眼眶取血,用ELISA法检测免疫效果。结果显示:4只小鼠中,第2号和第4号小鼠免疫效果较好(图2),故选这2只小鼠用于抗体库的构建。ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2009,25(2)筛选后抗体库的噬菌体投入产出比(Yield)逐渐增高,说明携带的抗Daudi细胞膜抗原的噬菌体抗体得到明显富集。当筛选到第6轮时,噬菌体投入产出比较第5轮比未见明显提高,说明已达到饱和状态。
153
架区(FRs)定位,发现轻链和重链可变区氨基酸均由3个CDR区和4个骨架区组成,其中重链的CDR3氨基酸序列变化显著,FRs仅有轻度变化;重链CDR3序列的变化可能与不同的Fab抗体结合Daudi细胞不同膜抗原有关。
2.6 阳性克隆的可溶性表达和Westernblot鉴定 SpeI/NheI分别酶切4个阳性克隆质粒DNA,除去噬菌体的gIII片段,自身环化后电转化XL1-Blue。挑取单个菌落培养扩增后提取质粒DNA,以XhoI/NotI酶切鉴定gIII是否被切除,若基因III片段已切除,则应切出约700bp的片段,若基因III片段未切除,则切出约1200bp的片段。电泳结果如图6所示,4阳性克隆均可切除约700bp的目的片段,而对照质粒切除1200bp片段,说明各阳性克隆基因III片段均已切除,各阳性克隆菌经IPTG诱导后可表达可溶性Fab抗体。挑选阳性克隆2的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE电泳后进行Westernblot,结果如图7A所示:在还原条件下,链间二硫键遭到破坏,在Mr约25000处出现特异性条带;在非还原条件下链间二硫键未遭破坏,则在Mr约为55000处出现特异性条带;而阴性对照未出现任何条带。进一步将阳性克隆2的可溶性Fab抗体与SDS-PAGE分离并转移到醋酸纤维膜上的Daudi细胞膜蛋白做Westernblot,结果如图7B所示,Fab抗体能与Daudi细胞膜蛋白特异性结合,其Mr约为35000。
图4 轻链J基因插入的SacI/XbaI酶切鉴定
Fig4 LightchainJinsertionidentificationbySacI/XbaIdigestion
M:1kbDNAmarker;1-9:No.1,2,3,4,5,6,9fromthenineran-domclonescontainedabout680bppositiveJfragmentbydigestionwithSacI/XbaI.
图5 Fab插入的SacI/SpeI酶切鉴定
Fig5 FabinsertionidentificationbySacI/SpeIdigestion
M:1kbDNAmarker;1-9:No.1,2,3,6,7,9fromtheninerandomclonescontainedabout1500bppositiveFab(VHCH1-VLCL)fragmentbydigestionwithSacI/SpeI.
表1 亲和筛选对噬菌体抗体的富集效应Tab1 Selectiveenrichmentofphageantibody
Roundsofpanning123456
Daudicells5.0@1062.5@1065.0@1052.5@1055.0@1042.5@104
Phagesnput(cfu)i
3.1@10112.2@10116.4@10101.5@10112.6@10111.4@1011
Phageseluted(cfu)
2.2@1059.7@1058.6@1055.4@1064.7@1072.6@107
Yield(%)
7.1@10-4.4@10-1.3@10-3.6@10-1.8@10-1.9@10-765544
Washingtimes
1510101515
图6 gIII切除的XhoI/NotI酶切鉴定
Fig6 gIIIremovalidentificationbyXhoI/NotIdigestion
M:1kbDNAmarker;1-4:Sel-fligatedpositivecloneFabC1,FabC2,FabC3andFabC4containedabout700bpfragmentbydigestionwithXhoI/NotI;5:Controlcontainedabout1200bpfragmentbydigestionwithXhoI/NotI.
Footnote:Yield(%)=(No.ofphageeluted)@100/(No.ofphageinputted).
2.5 阳性克隆的筛选和测序 将第6轮筛选后的菌株铺板,随机挑选45个单菌落制备mAb噬菌体液,以ELISA法检测对人B细胞淋巴瘤Daudi细胞的结合活性,4个克隆呈阳性,阳性率为8.9%。上述4个阳性克隆经37e过夜培养后,提取质粒DNA进行测序。经与GenBankIg基因库已知序列进行同源性分析,结果证实4个克隆均为鼠源性Ig,其中阳性克隆FabC1、FabC2、FabC3和FabC4的轻链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白J轻链可变区氨基酸序列(No.CAD32499.1)同源性分别为80%、91%、94%和90%;重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白Ig重链可变区氨基酸序列(No.P01807)同源性分别为95%、89%、88%和92%。通过对互补决定区(CDRs)和骨
图7 Westernblot分析Fig7 Westernblotanalysis
A:WesternblotprofileofFabantibodyfromFabC2.M:Proteinmarker;1:Fabinreducingcondition;2:Fabinnon-reducingcondition;3:Nega-tivecontrolofpComb3H-SSplasmidtransformedbacterialcelllysates.B:ThespecificityofFabantibodiestowardthemembraneantigensoftheBlymphomacellsbyWesternblot.M:Proteinmarker;1:WesternblotofDaudicellsproteinwithFabantibodyfromFabC2.1543 讨论
ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2009,25(2)
回收和扩增,为最终筛选出特异性、高亲和性的抗Daudi细胞特异性的噬菌体抗体创造条件。经过6轮
富集筛选,我们获得了4个能与Daudi细胞特异性结合的阳性克隆。经基因序列测定,发现4个克隆的重链可变区和J轻链可变区序列均存在少数核苷酸及氨基酸的差异,说明它们来自不同的克隆。通过对互补决定区(CDRs)和骨架区(FRs)定位,发现轻链和重链可变区氨基酸均由3个CDR区和4个骨架区组成,其中重链CDR3氨基酸序列变化显著,FRs仅有轻度变化;重链CDR3序列的变化可能与不同的Fab抗体结合Daudi细胞不同膜抗原有关。
总之,我们应用噬菌体表面呈现技术成功构建了抗B细胞淋巴瘤Daudi细胞系的Fab噬菌体抗体库,由此筛选和鉴定出针对Daudi细胞系膜抗原的抗体,为进一步对B细胞淋巴瘤进行导向治疗及影像学研究奠定了实验基础。参考文献:
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2006,
55(12):
本研究以人B细胞淋巴瘤Daudi细胞免疫
BALB/c小鼠,提取脾淋巴细胞RNA,RT-PCR扩增轻链J基因和重链Fd基因,分别将之克隆入pComb3H-SS载体,电转化XL1-Blue菌株,经辅助噬菌体VCSM13超感染后成功构建了Daudi细胞系Fab噬菌体抗体库。其库容量约为3.13@10,与国内外应用同一系统构建的抗体文库的容量相近
[6]7
。在试
验过程中,为了保证抗体库的多样性,我们采用了以下措施:首先,提取脾细胞中的总RNA,可降低RNA分解的机率,保证无poly(A)尾或poly(A)尾很短的mRNA不损失。其次,PCR引物在保证抗体基因多样性方面起着至关重要的作用,它影响着抗体库能否真实反映原始抗体基因的分布情况,实验中我们参照美国Scripps研究所鼠源抗体库构建的引物设计了20条引物,针对小鼠重链5c端的9条,3c端的IgG1、IG2a和IG3亚类各1条;J轻链5c端引物7条,3c端1条。再其次,因抗体重链的VH区域在抗原识别和结合方面起重要作用,因此先克隆轻链基因,后克隆重链基因,以优先保证重链基因的多样性。最后,制备高质量的感受态细胞,对电转化参数进行优化,以便提高转化效率,同时增加电转化次数,提高库容量。
目前文献报道的特异性噬菌体抗体,多数是用固相纯化抗原筛选获得的。对于无法提纯或抗原性质不确定的肿瘤细胞表面抗原,采用传统的筛选方法可使抗原失活,因而在一段时间内抗体库没有被
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用于对肿瘤特异性抗体的筛选。近年,国内外相继出现用瘤细胞直接从噬菌体抗体库中筛选肿瘤特异性抗体的报道。B细胞淋巴瘤的瘤细胞膜上暴露有多种B淋巴细胞分化抗原(如CD20、CD19、CD22),95%的B细胞淋巴瘤患者的瘤细胞有CD20分子表达,且表面密度很高,而在其他正常组织以及多能淋巴干细胞均不表达。基于此,我们采用完整的B细胞淋巴瘤Daudi细胞包被6孔板,对所构建的噬菌体抗体库进行6轮筛选。为了筛选出特异性、高亲和性的抗Daudi细胞特异性的噬菌体抗体,在进行抗体库筛选中,将包被的Daudi细胞数由第1轮的5@10降至第6轮的2.5@10,并逐渐加大TBS/Tween-20洗板次数,从而减少了噬菌体与孔壁的非特异性吸附,并减少了含有低亲和力抗体的噬菌体与抗原的结合,使含有高亲和力抗体的噬菌体得以
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