华肖菝葜组织培养技术的初步研究

2022-08-16 来源：汇智旅游网

安徽农学通报，AnhuiAgri.Sci.Bull.2016，22（16）

27华肖菝葜组织培养技术的初步研究

弓

（1山西中医学院，山西晋中

强1王贵军2

030100）

030619；2阳曲县农业委员会，山西太原

摘要：为了更好地开发利用华肖菝葜，该研究以华肖菝葜幼嫩带芽茎段为外植体，以MS为基本培养基，研

究了不同植物激素组合对华肖菝葜组织培养的影响。试验结果表明：外植体的最佳消毒方式为20%次氯酸钠消毒20min，最佳启动培养基为MS+6-BA6.0mg/L+NAA0.15mg/L+活性炭1000mg/L，在启动培养基上培养25d左右诱导率达到76%。中图分类号R282.71

关键词：华肖菝葜；组织培养；植物激素；外植体

文献标识码A

文章编号1007-7731（2016）16-0027-03

TissueCultureTechnologyofHeterosmilaxchinensisWang

GongQiang1etal.

（1ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinzhong030619，China）

Abstract：TheaimoftheresearchwastodevelopandutilizeHeterosmilaxchinensisWangbetter.TakingtheyoungstemofHeterosmilaxchinensisWangastheexplant，usingtheMSasthebasicculturemedium，theeffectsofhor⁃monecombinationoncallusformationandplantletregenerationofHeterosmilaxchinensisWangwerestudiedinthispaper.Theresultsindicatedthat：Theoptimumdisinfectionmethodofexplatrtswasdisinfectingwith20%sodiumhy⁃000mg/L，withtheinductionratebeingreach76%，whencultivatedininitialmediumfor25d.Keywords：HeterosmilaxchinensisWang；Tissueculture；Planthormone；Explant华肖菝葜为百合科华肖菝葜（HeterosmilaxchinensisWang）或短柱肖菝葜（HeterosmilaxyunnanensisGagneb）的攀援灌木，主要产地为四川中部至东南部、云南东南部、广西西南部和广东北部。生于海拔300～2100m的山谷密林中或灌丛下［1］。白土苓为华肖菝葜或短柱肖菝葜的干燥块茎，收载于《中华本草》，其味甘、淡，性平，具有清热利湿、解毒消肿等作用，用于小便淋湿、白浊、带下、痈肿消毒等症［2］。白土苓用药历史长，与中国药典收载的土茯苓不仅药名相近，而且历代本草常以同药名土茯苓

［3］记载。《本草纲目》一谓“土茯苓有赤白2种，入药用白者

pochloritefor20min.TheoptimuminitialmediumwasMS+6-BA6.0mg/L+NAA0.15mg/L+activatedcarbon1

种子发芽率低，扦插或嫁接较难成活［10］。为了更好地开发利用保护这一野生资源，笔者对华肖菝葜的组织培养技术进行了初步研究。采用组织培养，可以快速获得大量无菌苗，对保护这一野生资源具有重要意义。

1.1

材料与方法

材料

试验用的华肖菝葜外植体取自上午09：00—

11：00当年萌生的健壮带芽茎段。试剂：蔗糖、琼脂、酒析纯。1.21.2.1

试验方法培养基配制

精、次氯酸钠、6-BA、NAA、HCl、活性炭，以上试剂均为分

良”，所称白者为白土茯苓，赤者为土茯苓。在我国很多地区常把白土茯苓作土茯苓使用，混用历史较悠长，市场上药材品种混乱，真伪难辨别［4］。最新研究表明，华肖菝葜提取物中含有β-谷甾醇、棕榈酸和硬脂酸［5-6］，在利尿、抗炎、抑菌、解毒、肿瘤抑制等方面具有显著作用［7］。

华肖菝葜入药部位根的生长年限较长，资源更新较慢。近年来，这一野生资源由于人们的过度挖掘，日益减少，加之其花序小，单性异株，种子难于采收［8-9］。华肖菝葜的繁殖主要依靠自然分蘖或实生繁殖，但分蘖能力及

实验需要添加其他物质（6-BA、NAA、活性炭等），定容至1000mL，用1mol/LNaOH调节培养基pH至5.8。最后培养基中加9g的琼脂和30g蔗糖，在121℃高压灭菌20min，备用。在配制母液时，把Ca2+与SO42-、Ca2+与PO43-放在不同的母液中，以免发生沉淀。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发

收稿日期：2016-07-02

以MS培养基为基本培养基，根据

作者简介：弓强（1986—），男，山西壶关人，硕士，助教，研究方向：药用植物病毒检测。

剪去残伤及叶片，先用软毛刷蘸洗衣粉水轻刷干净，然后

外植体消毒

取当年萌生的华肖菝葜带芽茎段，

5表2

时间（min）

10152025安徽农学通报，AnhuiAgri.Sci.Bull.2016，22（16）不同消毒时间对外植体污染率的影响总瓶数（个）

2020202020污染瓶数（个）

149746污染率（%）

453520307用流水冲洗30min后，再用无菌水冲洗3次。在超净工作台上用70%的酒精浸泡15s，用20%的次氯酸钠溶液消毒，采用5个不同的时间分别处理5、10、15、20、25min。消毒好的外植体用无菌水冲洗5次，用消毒滤纸吸干水分，备用。在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。1.2.3

消毒滤纸吸干水分，接种到芽诱导培养基（A0-A12）上。培养基A0～A12植物生长调节剂为6-BA、NAA，如表1所示。30d后统计萌芽数量，计算诱导率。

表1

培养基序号

A0A1A2A3A4A5A6A7A8A10A11A12A9

不同培养基6-BA、NAA的配比

6-BA（mg/L）0246246246246IAA（mg/L）0.050.050.050.10.10.150.150.150.20.20.20.102.2启动培养华肖菝葜的茎芽在接种10d左右即有部

分腋芽萌动，20d后除培养基A0处理外均有芽发生萌动。35d有叶片生成（图1）。试验中出现了褐化现象，在培养基中加入1000mg/L活性炭之后褐化的外植体明显减少。

启动培养消毒好的外植体用无菌水冲洗5次，用

表3为不同生长调节素添加对华肖菝葜茎芽诱导的影响结果。由表3得知，培养基A9为最佳处理，诱导率达76%。因此，该培养基组（MS+6-BA6.0mg/L+NAA0.15mg/L+活性炭1000mg/L）可选为华肖菝葜最佳启动培养基。

图1

表3序号A0A1A2A3A4A5A6A7A8A10A11A12A9

处理35d时华肖菝葜的生长情况

不同生长调节素添加对华肖菝葜茎芽诱导的影响接种数

（个）30303030303030303030303030诱导数（个）24791014111523121787

褐化瓶数（个）

5713695879

诱导率（%）1323302333463650762640566褐化率（%）172330432030401727372330471.2.4

光照强度2000～2500lx［11］。

培养条件培养温度为25～28℃，光照时间14h/d，

2.1

结果与分析

外植体最佳消毒时间的确定

灭菌剂的要求是灭菌

效果好，从植物组织上清除容易，对人体无害，无环境污染。70%～75%的酒精是最常见的表面灭菌剂，具有较强的穿透力和灭菌作用，但对植物材料的杀伤作用也很大。氯化汞的灭菌效果极佳，但缺点是易在植物材料上残留，对环境危害大，对人有毒害。次氯酸钠是一种较好的灭菌剂，灭菌能力强，不易残留，对环境无害。在多次预试验中用次氯酸钠对外植体消毒，其效果较好。因此，实验采用次氯酸钠对华肖菝葜带芽茎段消毒。由表2可以看出，用20%次氯酸钠对华肖菝葜带芽茎段消毒，在处理25min时，材料的污染率最低，效果最好，因此确定外植体的最佳消毒时间为20min。

1110143讨论

在本次试验中出现了褐化现象，这主要是在初期培

养中，基本培养基上中高浓度的盐可以促进外植体内酚类物质的大量分泌，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。试验发现，当6-BA添加量减少时，褐化率明显降低，这主要是因为6-BA能促进酚类化合物的合成，并具有刺激多酚氧化酶活性的作用［12-13］，从而促进（下转33页）

籽粒色泽好较差

表4

处理12345重复17851.758319.459148.359147.158471.70差异显著性分析

基本苗越冬前茎蘖穗数株高

处理222

（万/hm）数（万/hm）（万/hm）（cm）45336.15390.15997.50840.45677.10658.3588.3387.33倒伏

情况轻倒重倒

2.2不同处理产量构成因素及产量的比较由表2可知，

处理3（省大配方2）在穗粒数和千粒重方面表现最好，较处理1（常规对照）分别增加1.87粒和1.96g，增产率达11.37个百分点；其他各处理在产量上均较处理1（常规对照）增产4%以上，但处理2因早衰较明显，致千粒重最低。由表3可知：F0.05=3.48＜F=3.56＜F0.01=5.99，表明处理间产量在1%水平上有差异。进一步用最小显著差数法（LSD法）进行多重比较，结果表明，只有处理3比处理1在a=0.05水平上增产达显著水平，其他任何两处理之间，产量差异均未达显著水平。

表2

各处理产量构成因素及产量比较

3结论与讨论

产量（kg/hm2）

重复2重复37970.708813.858202.459167.408796.909491.708947.808244.008816.258990.55较处理1比差异显著性（kg/hm2）5%1%平均值增产8212.10aA8563.10351.00aA9145.65933.55bA8779.65567.55aA8759.50547.40aA（1）试验结果表明，各处理小麦到越冬前茎蘖数均较常规施肥（处理1）高；穗数以省大配方3最高；株高以常规施肥和高氮配方最高，均在90cm左右；抗倒性以省大配方3最好，常规施肥和省大配方4最差，严重倒伏，这可能是4都于小麦返青期追施了氮肥；小麦籽粒色泽除处理5较差（不知是何原因）外，其余均很好。

（2）省大配方2（处理3）在穗粒数和千粒重方面表现最好，较常规施肥分别增加1.87粒和1.96g，增产933.6kg/hm2，增产率达11.37个百分点；其他各处理在产量上均较常规施肥增产4%以上，但处理2因早衰较明显，致千粒重最低。

（3）方差分析结果表明，不同处理间产量在1%水平上有差异。多重比较结果显示，除省大配方2较常规施肥在1%水平上增产显著外，其余各处理间产量差异均不显著。

（4）从小麦产量表现、抗倒性、籽粒商品性等方面综合评价，以省大配方2，即每1hm2用以22-13-10的配方肥750kg作基肥，小麦拔节期再追施尿素150kg表现最好。但省大配方2在阜南县并非最佳配方，因为阜南县目前绝大部分土壤磷素缺乏不明显，甚至有些土壤出现富磷现象，因此在此配方基础上，适当减磷更好。

Chem，1976，23：9.

因为处理4基肥中钾肥比例较高，而常规施肥和省大配方

穗数穗粒数千粒重产量比处理1增增产率

处理22

（万穗/hm）（粒/穗）（g）（kg/hm）产（kg/hm2）（%）12345642.30665.70643.05677.10658.3528.2328.9030.1027.6028.1045.2944.5147.2546.9847.35表3

变异原因自由度处理间重复间总变异

10144平方和6148.06.8742.928212.058563.059145.658779.658759.55351.00933.60567.60547.504.276.916.6711.37

方差分析均方2185.731063.64614.81

F值F0.05

F0.01

3.563.485.9914890.98（责编：张宏民）

（上接28页）了外植体的褐化程度。在培养基中加入活性

炭之后褐化的外植体明显减少，因为活性炭表面积大，可以吸附非极性物质及色素大分子，减少一些有害物质的影响。华肖菝葜在到目前为止所用过的培养基中，没有看到一般愈伤组织的形成，这是因为其形成的各种微小的愈伤组织随着根系的进一步分化逐渐消失［14］，因此也就没有像其他植物那样建立起茎、根等营养体接种到培养基上形成愈伤组织后再分化的系统。参考文献

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（责编：张宏民）

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