绿茶茶多酚近红外光谱定量分析模型优化研究

食品科学※分析检测

绿茶茶多酚近红外光谱定量分析模型优化研究

林 新，牛智有*

(华中农业大学工程技术学院，湖北 武汉 430070)

摘　　　要：采用NIR Systems6500和InfraXact Lab型近红外仪分别对158份绿茶未粉碎品和粉碎样品进行光谱扫描，利用正交试验设计，分别采用主成分回归、偏最小二乘、改进偏最小二乘3种校正方法，并对原始光谱分别进行不同的预处理，建立了绿茶茶多酚定标模型，利用目标函数法对模型进行评定，并对评定的最优模型适用性进行验证。试验结果为：利用NIR Systems6500型近红外仪对绿茶粉碎样品扫描的光谱采用改进偏最小二乘法进行定标，在标准正常化+趋势变化散射处理、二阶导数处理(取点间隔为1)、平滑处理取点间隔为4和二次平滑处理取点间隔为8组合的光谱预处理下建立的模型最优，其目标函数值为95.74%，验证相对标准差(RSD)为4.52%，相对分析误差(RPD)为2.52%。结果表明：采用正交试验设计能够综合考察不同的校正方法和预处理方法对近红外定标模型的影响，利用近红外光谱分析法能够实现绿茶中茶多酚含量的定量检测，所建立的最优模型具有很好的预测准确性和适用性。

关键词：近红外光谱；绿茶；茶多酚；定量分析模型；优化研究

Optimization of Models for Quantitative Analysis of Tea Polyphenols in Green Tea by Near Infrared Spectrophotometry

LIN Xin，NIU Zhi-you*

(College of Engineering and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Abstract ：158 non-comminuted and comminuted green tea samples were scanned by NIR Systems 6500 and InfraXact NIRanalyzers. An analysis model for quantitation of polyphenols in green tea was developed through orthogonal test design andvalidated with principle component regression (PCR), partial least square (PLS) and modified PLS. The models were evaluatedby the objective function method and the applicability of the optimal models was validated. The optimal model was obtained byusing the NIR Systems 6500 analyzer with comminuted samples by modified PLS and the optimum analytic conditions for spectraldata preprocessing were standard normal variate (SNV)/detrend scatter, second derivative treatment (the interval for one point),smoothing interval for four points and the secondary-smoothing interval for eight points. This optimal condition leaded to theobjective function value of 95.74% and RSD and RPD of validation of 4.52% and 2.52, respectively. The results showed thatorthogonal experiment design could comprehensively evaluate the effect of methods for validation and spectral data preprocess-ing on the models. Quantitative analysis of polyphenols could be realized by NIRS and this optimal NIRS model had very goodprecision and applicability.

Key words：near infrared spectroscopy；green tea；polyphenols content；quantitative analysis model；optimization中图分类号：O657.33 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)10-0144-05

近红外(near infrared，NIR)光是指波长介于可见光区与中红外区之间的电磁波，其波长范围约为0.78～2.5μm，近红外光谱分析是指利用近红外谱区包含的物质信息，主要用于有机物定性和定量分析的一种分析技术[1]。近年来，近红外光谱分析技术因具有速度快、效率高、成本低、无污染和能实现多组分同时检测等特点[2-4]，在

收稿日期：2008-01-23

基金项目：湖北省自然科学基金项目(2007ABA351)

饲料工业、医药行业、食品和农产品等诸多领域得到广泛的应用研究[5-8]，并已逐渐得到大众的普遍接受和官方的认可[2]。

茶叶是我国重要经济农作物，中国不仅是产茶古国和产茶大国，也是世界绿茶主产国。我国茶叶生产中，绿茶占70%以上，世界茶叶市场上，绿茶为23%左右，

作者简介：林新(1982-)，男，硕士研究生，研究方向为茶叶品质近红外检测。E-mail：linxin@webmail.hzau.edu.cn*通讯作者：牛智有(1965-)，男，副教授，博士，研究方向为农产品加工技术与装备。E-mail：nzhy@mail.hzau.edu.cn※分析检测食品科学2009, Vol. 30, No. 10145

其中70%以上来自中国[9]。因此绿茶是我国优势茶叶产品，是出口创汇和国内消费的主要茶类[10]。茶多酚是茶叶主要化学成分，它含量高，具有抗癌、抗肿瘤、防衰老、保健美容和调节免疫功能等药理药效，对茶叶品质的影响最为显著[11]。茶多酚常规的检测方法有酒石酸亚铁比色法、高锰酸钾滴定法和高效液相层析(HPLC)等，但这些方法都需要繁琐的化学实验，不仅周期长、费用高、易产生污染，而且测定结果可靠性差。目前国内外学者在利用近红外技术进行茶叶中茶多酚含量的检测有初步的研究[12-16]，表明应用此方法进行茶多酚定量分析是可行的，但目前采用不同光谱仪器和不同的样品处理(不粉碎与粉碎)进行实验，并将正交试验设计用于确定最佳定量校正方法和光谱预处理方法方面的研究还未见报道。

本研究借助FOSS公司生产的两种不同型号近红外光谱仪，对不同的定量校正方法和光谱预处理方法对定标模型的影响进行正交试验，利用目标函数法评定最优模型，旨在比较分析不同仪器和样品处理、不同定量校正方法和光谱预处理方法对茶叶中茶多酚定量分析模型的影响，以期为茶多酚的定量、无损和快速检测提供一种有效的方法，并提出一种能够快速、科学地评定最优模型的方法。１1.1

材料与方法

样品收集与制备

从茶叶市场、超市和茶场收集到同年春、夏、秋

扫描前，两台仪器均需预热1h，自检通过后方可正常使用。扫描过程中用空调保持室温25℃左右，并严格控制室内湿度，保持环境的一致性。随机抽取样品，按照各仪器要求进行装样，对每份样品进行三次装样，取三次扫描平均光谱作为分析光谱。1.31.3.11.3.2

研究方法

茶多酚含量的化学分析采用酒石酸亚铁比色法测定。

定量校正方法

WinISI软件中提供了多种定标技术，即定量校正方法，如主成分回归(PCR)、偏最小二乘(PLS)、改进偏最小二乘(MPLS)和人工神经网络(ANN)等。其中PCR只利用光谱扫描数据矩阵进行主成分分析计算得分，而没有利用实验室数据，其定标效果一般较差；ANN适用于大样本的定标建模。PLS和MPLS都是利用光谱数据矩阵和实验室数据矩阵计算得分以达到对光谱数据的简化，不同的是MPLS在每一次循环运算后对数据进行归一化处理，并对整段光谱进行处理，所以一般表现出较优的建模性能。为了考察不同定量校正方法对茶多酚含量定标模型的影响，本实验分别采用PCR、PLS和MPLS三种方法在全谱区对绿茶中茶多酚含量建立定量校正模型。1.3.3

光谱预处理方法

为了去除高频随机噪音、基线漂移和样品不均匀等影响，实验利用WinISI软件对采集的光谱数据进行必要的光谱预处理。预处理方式包括：散射校正、导数处理、平滑处理和二次平滑处理。本实验考察不同光谱预处理方法对定标模型的影响。1.3.4

正交试验设计

表１　　　　　因素水平表

Table 1 Factor and levels of orthogonal test for optimizingquantitative calibration and spectral data preprocessing methods

因素

水平A定标B散射C导数D导数处理E平滑处理F二次平滑处理

方法123

PCRPLSMPLS

校正NoneSNV+DMSC

处理0阶1阶2阶

间隔点数

148

间隔点数

148

间隔点数

148

三个季节的绿茶样品158份，样品等级分特级、一级、二级和三级，源产地包括江苏、浙江、安徽、湖北、湖南、河南、福建等国内重要绿茶产区，具有良好的代表性。将每份样品分为2等份，各35g，其中一份不经任何处理，一份经磨碎处理过40目筛，要求粒径大小、均匀度一致。所有样品需密封冷藏保存，备用。1.2

仪器及光谱采集

本实验分别使用丹麦FOSS TECATOR公司生产的两种不同型号的近红外分析仪对1.1中制备的样品进行光谱扫描。定标和模型验证均采用仪器配套化学计量学软件WinISI Ⅲ v1.50e。

仪器1#：NIRSystems6500型近红外分析仪，波长范围：400～2500nm；扫描速度：1.8次/s；检测器：硅(400～1100nm)，硫化铅(1100～2500nm)；工作温度：15～32℃；取点间隔：2nm；扫描次数：32。

仪器2#：InfraXact Lab型近红外分析仪，其数据可与NIRSystems6500兼容。波长范围：570～1850nm；检测器：硅(570～1100nm)，铟镓砷(1100～1850nm)；操作温度：0～40℃；取点间隔：2nm；扫描次数：32。

注：None：无散射校正，SNV+D：标准正常化+趋势变化法散射处

理，MSC：多元离散校正。

综合考虑以上不同的定量校正方法和光谱预处理方法，有6种不同的处理或设置，将其设定为6个因素，并且各因素之间不产生交互作用，每个因素取3个水平，其具体内容见表1。如果按各因素水平的所有可能搭配进行实验，软件需要做36=729次运算，全部试验就需要729×4=2916次运算，本实验利用试验优化设计的思路[17]，将不同的校正方法和预处理方法对模型的影

146 2009, Vol. 30, No. 10

食品科学1.03

d

0.77吸光度0.520.270.02

570

※分析检测

响设计成正交试验。实验选取L27(313)正交表中第1、2、4、8、11、13列进行试验安排，只需经过27×4=108次试验即可得到结果。1.3.5

定标模型优劣的评价方法

在WinISI Ⅲ软件中得到的定标结果指标中，SEC(定标标准偏差)是回归读数和实际读数吻合程度的标志，SEC越低，说明近红外分析结果与化学分析结果越吻合，可信度越高；R2(定标决定系数)表示近红外分析值与常规方法分析值线性关系的密切程度，R2越大越好；SECV(交叉验证标准差)是定标建模过程中进行交叉验证时得到的近红外预测值与化学分析值的标准偏差，通过SECV可以大致评估定标模型的准确度。由此看来，一个好的定标方程要求有低的SEC和SECV值和较大的R2。但在实际定标过程中经常会出现以上指标值十分接近或者产生矛盾的情况，使得最优模型的选择出现两难局面。据文献[18]提供的一种有效评判定标模型优劣的目标函数f(x)=R/(1+SECV)来评估检测模型预测性能，兼顾模型的两个重要参数以确定最优模型，目标函数值越大，校正模型的预测效果越好，因此，本优化研究将目标函数值f作为正交试验结果的评价指标，目标函数f值越大，说明模型的预测效果越好[18]。２2.1

结果与分析

绿茶样品近红外反射光谱

1.36

a

1.05吸光度0.740.440.134000.820.62吸光度0.430.230.03

400

925

1449波长(nm)c

1.23吸光度0.860.500.13

570

1974

2498

b

890

1209波长(nm)

15291848

a.仪器1#未粉碎样；b.仪器1#粉碎样；c.仪器2#未粉碎样；d.仪器2#粉碎样。图　１　　　　　绿茶样品近红外光谱图

Fig.1 Near infrared spectrograms of integrated and crushedgreen tea samples on NIR Systems 6500 and infraxact NIR

analyzers

图1为绿茶样品的近红外反射光谱图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度lg(1/R)，其中R为反射率。

近红外反射光谱是利用有机物中含有C－H、N－H、O－H等化学键的泛频振动或转动，以漫反射方式获得在近红外区的吸收光谱。由图1可以看出，对仪器1#而言，C－H键组合频出现在1695～2400nm之间，谱带较强；O－H键有两个特征谱带，1940nm的组合频和1440nm的O－H伸缩振动一级倍频；N－H键伸缩振动的一级倍频在1500nm附近，伸缩振动和弯曲振动的组合频在2000nm附近，并在1972nm处有一个组合频谱带。由于仪器2#与1#检测器和光谱范围的不同，所获得的光谱图也有所不同。丰富的光谱信息对绿茶茶多酚的近红外光谱定量分析提供了大量的信息。2.2

异常样品的剔除

异常样品指浓度标准差或光谱数据存在较大误差的样品，其对定标模型的不良影响是不可忽视的，因此

925

1449波长(nm)

19742498

建模前必须将其从样品集中剔除。利用WinISI Ⅲ对光谱文件进行聚类分析，分析方式为PL1方式，即利用扫描数据矩阵及茶多酚含量的实验室数据计算得分，解释光谱间差异，马氏距离超过3.0的被视为异常样品，均被剔除。将经过异常剔除后的样品按茶多酚浓度梯度采用隔三选一法进行分集，定标集和验证集样品个数比例约为3:1，结果见表2。

表　２　　　　样品分集结果及茶多酚含量实测值

Table 2 Diversity results of green tea samples and measured

values of tea polyphenols content

定标集验证集样品仪器样品最小最大平均标准样品最小最大平均标准处理型号数值(%)值(%)值(%)差(%)数值(%)值(%)值(%)差(%)不粉碎1#11120.7943.6632.063.793725.4239.8632.303.492#11421.5943.6632.303.813725.8341.5532.333.531#11620.7943.6632.224.043825.3041.6632.313.682#11321.5943.6632.374.003725.8341.6632.413.611.60

890

1209波长(nm)

15291848

粉碎※分析检测

2.3

定标结果与分析评价

食品科学2009, Vol. 30, No. 10147

偏小。所有最优模型均是在MPLS定标方法下得到的，可见此法较其他两种方法更适用于茶叶中茶多酚含量的定标。其中PCR方法下的f值都较小，低于90%，最低只有68.26%，出现在不粉碎样品在2#分析仪上的第1次试验。光谱预处理大部分以A3B2C3D1E2F3搭配较好，但不粉碎样品在2#分析仪上得到的结果异常，反而是在无散射处理下的结果最好，这与样品前处理和仪器波段范围都存在紧密的联系，说明此模型还有待进一步研究。从不同仪器结果看，1#仪器的结果比2#好，可以确定较宽波长范围比较适合于茶多酚的定标建模。从不同的样品处理看，粉碎样品的结果比未粉碎样品好，可以确定样品粒度对茶多酚定标建模存在影响，粒度越均匀效果越好。总体看，以粉碎样品在1#仪器上的第24次试验得到的定标模型最优，其f值高达95.74%，且这种情况下的27次试验得到的f值基本都高于80%，只有第9次的f值为76.73%，其他条件下则达不到。2.4

校正模型适用性检验

最优模型被评定之后，需要用外部验证的方法对模型进行检验，以进一步确定模型的准确性和适用性。试验利用2.1中确定的未参加定标建模的独立验证集对以上四种条件下获得的最优定标模型进行检验，验证结果统计见表4。

表　４　　　　最优模型验证结果

Table 4 Validation results of optimal models

样品处理仪器预测标准(%)偏差(%)R2相对标准差(%)相对分析误差(%)不粉碎粉碎

1#2#12

##

按照1.3.4的设计，利用上述定标集对茶多酚含量进行试验建模，包括不粉碎样品分别在1#、2#近红外分析仪上的建模和粉碎样品分别在1#、2#近红外分析仪上的建模，利用正交试验设计总共建立了108个模型。各定标模型的评价指标f值经过计算后列于表3，本试验采用比较目标函数f值的大小选择最优模型[19]。

表３　　　　正交试验结果

Table 3 Results (f value，%) of orthogonal test for integrated

and crushed green tea samples on two NIR analyzers

f值(%)

试验号 不粉碎

1

123456789101112131415161718192021222324252627

#

粉碎

2

#

1#81.1781.1381.1683.7685.9984.6982.1781.3676.7394.1594.5993.1492.3292.3592.3994.1194.1194.1193.7994.9994.9594.695.4795.7493.999494.03

2#79.6879.4179.2791.587.6786.3281.3980.6978.591.3490.3691.1793.4493.493.2192.7692.7692.7694.4194.2994.4195.4995.3995.5193.4293.4593.55

74.2574.3374.5977.3677.0876.9687.7687.873.394.0893.7492.8188.3688.8488.8492.3692.3692.3693.8593.6693.6294.8794.8595.0592.8292.9293.08

68.2671.7479.2888.3587.4787.0779.4578.4974.2190.6690.4291.1889.1689.1690.2790.9890.9890.9892.9192.892.7891.391.2891.3891.9692.0292.18

1.582.031.461.42

0.130.380.50

0.830.760.89

4.896.284.524.38

2.211.742.522.54

－0.070.85

注： R2为预测决定系数。

采用相对标准差(RSD)和相对分析误差(RPD)对定标模型的定标效果和预测精度进行评价，当RSD小于10%且RPD大于2.5%时表明定标效果良好，预测精度高，所建立的定标模型可用于实际检测；如果RPD达到1.5%左右，模型预测能力普通，只可用于初步检测[20-21]。其中不粉碎样品在2仪器上得到的模型的RPD仅为1.74%(小于2.5%)，其RSD值也是最大的，说明此模型还有待进一步优化才能被用于实际检测。其他情况下的定标模型均达到预测精度要求，可应用于实际检测中。３

结论与讨论

由表3可以得出，除不粉碎样品在2#分析仪上的最优模型是第19次试验所建立的外，其余情况下均以第24次试验所建立的模型最优，其最佳水平组合为：A3B2C3D1E2F3，即定标方法为MPLS，散射校正为SNV+D，导数处理为2阶，导数处理间隔点数为1，平滑处理间隔点数为4，二次平滑处理间隔点数为8，目标函数f值分别都高达95.05%、95.74%和95.51%。不粉碎样品在2#分析仪上最佳水平组合为A3B1C2D1E1F2，即定标方法为MPLS，无散射校正，导数处理为1阶，导数处理间隔点数为1，平滑处理间隔点数为1，二次平滑处理间隔点数为4，目标函数f值为92.91%，明显

本实验综合考察不同型号近红外分析仪、不同样品前处理、不同定量校正方法和不同光谱预处理方法对茶叶中茶多酚定量分析模型的影响，并采用正交试验设计和目标函数法确定了最优模型，最后利用独立的验证集

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食品科学[8][9][10][11][12][13][14][15]

※分析检测

对最优模型进行检验，采用RSD和RPD两个统计量对定标模型的定标效果和预测精度进行评价，除不粉碎样品在InfraXact Lab型近红外分析仪定标结果目标函数值f为92.91%，验证结果RPD为1.74%，结果不理想外，其他组合都取得了满意的定标结果。

本研究中的定标建模均是在全谱范围内进行的，仍然可深入讨论在不同的光谱段进行建模，优化建模的波段范围，以便更好地提取光谱中有效信息，使定标模型得到进一步优化。

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