应用G-CSF动员骨髓干细胞治疗重型颅脑损伤的研究

沈阳部队　－２９６・　应用Ｇ—ＣＳＦ动员骨髓干细胞治疗重型颅脑损伤的研究　薛洪利　周江朝　于春泳　刘民培　邵双伟　许摘要锋　王志军　蔺　迪　探究重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈ—Ｇ—ＣＳＦ）治疗重型颅脑损伤的有效性及临床应用安全性。　将６０例重型颅脑损伤患者，随机分成实验组３０人，对照组３０人。实验组连续３天给予Ｇ—ＣＳＦ　３００　＿／天。　应用流式细胞仪监测并比较治疗前后外周血中ＣＤ３４　和ＣＤ１３３　细胞计数及磁共振波普分析（ＭＲＳ）评价治疗　前后受损部位的Ｎ一乙酰氨基酸（ＮＡＡ）含量，常规评价其功能恢复情况。监测外周血白细胞计数评价其安全　性。实验组治疗后ＣＤ３４　、ＣＤ１３３　细胞计数和受损部位的ＮＡＡ含量较治疗前明显增加（Ｐ＜０．０５），白细胞计　数同步增加（Ｐ＜０．０５）。治疗１个月时实验组ＧＣＳ评分较对照组略有改善，但差异无显著性（ｔ：０．０３２，Ｐ＞　０．０５），随访３个月、６个月时ＧＣＳ评分较对照组均明显升高（ｔ＝１．４１８，１．５９２，Ｐ＜０．０５），随访６个月时实验组　的疗效明显优于对照组（Ｚ：３．５７６，Ｐ＜０．０１），实验组未出现严重不良反应。用Ｇ—ＣＳＦ动员骨髓干细胞迁移　至脑损伤区域并分化为神经细胞，明显改善神经功能。　关键词粒细胞集落刺激因子重型颅脑损伤干细胞神经功能　重型颅脑损伤后继发不可逆性神经细胞坏　死，造成各项神经功能严重受损，甚至死亡。近年　来随着干细胞研究深入，发现骨髓干细胞是一组　具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞群，在　１．４研究方法全部患者均给予脑外伤的常规治　疗（包括必要的手术治疗、脱水降颅压治疗）。于　入院后１Ｏ天至半个月病情稳定时，实验组经患者　家属同意加用Ｇ—ＣＳＦ　１５０　ｔｘｇ，２／ｄ，皮下注射，连　用３天；丹参２０　ｍｌ　１／ｄ，静脉滴注；神经节苷酯　２０　ｍｇ　１／ｄ静脉滴注。对照组加用神经节苷酯　２０　ｍｇ　１／ｄ滴注；丹参２０　ｍｌ　１／ｄ滴注，共一个疗　程（两周）。　１．５观察指标观察Ｇ—ＣＳＦ治疗期间的不良反　生长和修复过程中起重要作用…。粒细胞集落　刺激因子（Ｇ—ＣＳＦ）是骨髓干细胞强有力的动员　剂，可以大大提高外周血的干细胞数量。我们试　用粒细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕ—　ｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，Ｃ—ＣＳＦ）动员自体骨髓干细胞治疗　重型颅脑损伤，取得满意效果，报告如下。　１对象与方法　应，治疗过程中，每天化验血液，行血细胞计数和　单个核细胞计数，实验组在用药过程中白细胞计　数应在８万以下。有无白细胞栓塞事件发生及骨　髓增生异常表现。用流式细胞仪检测治疗前、治　疗后３天、５天外周血ＣＤ３４　、ＣＤ１３３　细胞。磁　１．１病例选择我院重型颅脑损伤患者６０例，年　龄：１２～６９岁，均符合下列条件：（１）有明确颅脑　外伤史，受伤后２４　ｈ内人院；（２）深昏迷，昏迷在　１２　ｈ以上，意识障碍逐渐加重或出现再昏迷。　ＧＣＳ≤７分且Ｉ＞５分；（３）ＣＴ检查证实为脑挫裂伤　共振波普分析（ＭＲＳ）评价治疗前后受损部位的Ｎ　一乙酰氨基酸（ＮＡＡ）含量。流式细胞仪检测及　ＭＲＳ检查分别由两名不知分组情况的医师完成。　观察治疗前及治疗后１个月、３个月、６个月ＧＣＳ　评分及治疗前、后６个月ＮＡＡ含量的变化并随访　６个月时神经功能缺损评分。　１．５．１流式细胞检测我院医学实验科流式细胞　及各种颅内血肿，无其他脏器复合伤；（４）获其家　属知情同意者；（５）患者既往无心、脑、肝、肾疾患　及糖尿病等其它病或合并症者；人院前未接受其　他有关治疗；不属过敏体质者，治疗前无发热性疾　病。　仪（ＢＤ公司）进行检测，所有样品均标记ＦＩＴＣ—　患者入院后随即分为２组。治疗组：　ＣＤ３４　（ＩＱ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ公司）、ＰＥ—ＣＤ１３３　（德国美　１．２分组３０例，男性２３例，女性７例，年龄：１３～６９岁，平　天旎公司）２种细胞表面标记物的荧光单抗，同时　均年龄（４１．４８±１５．３３）岁；对照组：３０例，男性　２ｌ例，女性９例，年龄：１２～６７岁，平均年龄　（４０．０７　４－１６．９６）岁。　标记同色的荧光对照，以去除荧光非特异性结合。　所有数据均用设门法分析所得，其百分数表示在　单个核细胞中所占的阳性比率。　１．５．２磁共振波普分析（ＭＲＳ）　我院核磁共振　室（ＧＥ公司Ｓｉｇｎａ　ｃｖ／ｉ．１．５Ｔ）进行检测。于治疗　前及治疗后６个月分别检测同一部位受损脑区域　ＮＡＡ含量。参照文献　ｊ，ｃｒ波峰相对稳定，常被　１．３昏迷程度评定２组患者ＧＣＳ评分，分别为６．３７　－４１．１６和６．１７±１．２６，差异无显著陛（Ｐ＞０．０５）。　沈阳军区总医院神经外科１１０８４０　沈嘟队　作为观察指标。　曹　１．７统计学方法・２９７・　用作脑内能量代谢的内标物。本实验以ＮＡＡ／Ｃｒ　采用ＳＰＳＳ１１．５统计学软件进　行统计分析，检测数据均以均数±标准差（　±ｓ）　参照全国第四届脑血管病会　表示。采用均数间两两比较（ｔ检验）及非参数秩　和检验，以Ｐ＜０．０５为其差异显著的标志。　２结果　１．６疗效评定标准议制定的标准，采用改良爱丁堡＋斯堪的那维亚　法（ＭＥＳＳＳ）对神经功能缺损程度进行评分　。　依据患者神经功能缺损积分值的减少（功能改善　程度）及治疗后的生活能力状况（病残程度）分为　（１）基本治愈：功能缺损评分减少９ｌ％一１００％，　２．１完成及随访情况　实验组３０例均能完成疗　程，６Ｏ例患者均完成６个月随访，无失访者。　２．２实验组及对照组外周血干细胞的变化　流式　病残程度０级；（２）显著进步：功能缺损评分减少　４６％～９０％，病残程度１～３级；（３）进步：功能缺　损评分减少１８％一４５％；（４）无变化：功能缺损评　分减少１７％左右；（５）恶化：功能缺损评分减少或　增多１８％以上；（６）死亡。格拉斯哥昏迷记分法　（Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｃｏｍａ　Ｓｃａｌｅ，ＧＣＳ）。　细胞检测结果显示，实验组患者外周血ＣＤ３４　、　ＣＤ１３３　细胞随时间推移逐渐升高，到第３天时均　达到峰值（Ｐ＜０．０１），且与对照组相比明显增加，　随后又逐渐回落。而对照组ＣＤ３４　、ＣＤ１３３　细　胞则变化不大（Ｐ＞０．０５）。　０．０８　詈０．０６　０．０４　＋实验组ＣＤ３４＋　熏誊０．０２　０　即刻　３天　５天　＋一　实验组ＣＤ１３３￣　对照组ＣＤ３４＋　对照组ＣＤ１３３＋　时间（天）　注：与对照组比较Ｐ＜０．Ｏ１　附图重型颅脑损伤患者外周血ＣＤ３４　、ＣＤ１３３　变化　２．３实验组治疗后６个月受损脑区域ＮＡＡ／Ｃｒ比　治疗前明显增加（Ｐ＜０．０５），对照组治疗后６个月　２．４治疗前后ＧＣＳ评分比较治疗１个月时实　验组ＧＣＳ评分较对照组略有改善，但差异无显著　性（ｔ＝０．０３２，Ｐ＞０．０５），随访３个月、６个月时　较治疗前有所减少但无明显差别（Ｐ＞０．０５）。　表１　２组治疗前及治疗后６个月受损脑　区域ＮＡＡ含量（ＮＡＡ／Ｃｒ）　受损脑区域ＮＡＡ／Ｃｒ　组别　实验组　对照组　ＧＣＳ评分较对照组均明显升高（ｔ＝１．４１８，１．５９２，　Ｐ＜０．０５），差异有显著意义。　２．５随访６个月神经功能缺损评分比较６个月　例数　治疗前　３Ｏ　３Ｏ　０．２５－Ｉ－０．１２　Ｏ．２３±０．１３　治疗后　１．９０±０．５４　０．２１±０．１２　时实验组神经功能缺损评分较对照组明显改善，　差异有显著意义（Ｐ＜０．０１）。　２．６安全性评价实验组自治疗开始之日每日行　血常规检查至疗程结束后４ｄ，结果显示实验组　表２　２组治疗后６个月疗效比较（例）　周围血白细胞显著升高，治疗后第３　ｄ白细胞计　数为（５３．１８±１２．８０）×１０　／Ｌ，与对照组（９．９１±　２．８４）×１０　／Ｌ比较有显著性差异（Ｐ＜０．０１）；治　疗后２组患者肝、肾功能检查均无显著变化，Ｇ—　ＣＳＦ治疗组有１例患者出现轻微呼吸困难，１例　患者出现皮疹均给予抗过敏药物注射后缓解，其　《沈阻部队医药》　・２９８・　余患者均无不良反应，疗程结束后３～４　ｄ白细胞　计数均可恢复正常。　３讨论　损脑区域ＮＡＡ／Ｃｒ比明显增加，对照组治疗后较　治疗前有所减少。这可能与受损脑区域周围半暗　带神经细胞坏死所致，进一步说明Ｇ—ＣＳＦ可以　诱导内皮细胞的迁移和增殖，，促进损伤区及其周　边的血管增生，有利于神经元的存活和脑组织的　颅脑损伤目前的治疗仅限于对急性期生命的　挽救，后期的致残率及病死率陡升不下，原因在于　损伤后继发不可逆性神经细胞坏死，造成各项神　经功能严重受损。最新研究认为骨髓来源的干细　胞能够迁移到受损的脑组织区域并分化生成不同　积极修复。实验组外周血干细胞水平于治疗后第　五天已降至治疗前水平，但６个月受损脑区域　ＮＡＡ／Ｃｒ比治疗前明显增加，对照组无明显差别。　说明Ｇ—ＣＳＦ对骨髓干细胞的动员作用是一过性　的脑组织，包括神经细胞和其他类型的脑细　胞　Ｊ，为重型颅脑损伤的治疗带来希望。然而，　干细胞移植需要外科的干预，且ＮＳＣ数量少、分　布散、取材困难、无免疫原性ＮＳＣ系建立困难、转　染载体的选择困难以及异体移植存在的伦理学问　题等原因，使得ＮＳＣ在临床应用中受到很大限　制。临床上更需要探索侵害性少的治疗方法。已　知道给予Ｇ—ＣＳＦ可动员造血干细胞从骨髓进入　周围血，且已证实ＣＳＦ具有同时动员造血干细胞　和问充质干细胞的能力＿５ｊ。德国科学家Ｓｃｈａｂｉｔｚ　等研究发现在由谷氨酸盐诱导的兴奋毒性的细胞　培养中Ｇ—ＣＳＦ显示出明显的神经保护作用，而　在脑缺血鼠体内Ｇ—ＣＳＦ可缩小梗死体积，可能　与神经元ＣＳＦ受体的调节增加缺血半暗带　ＳＴＡＴ３的表达有关　。法国学者Ｓｉｘ等研究亦表　明在将Ｇ—ＣＳＦ应用于脑缺血鼠中可以缩小梗死　体积，提高生存率　。新近Ｓｈｙｕ等研究证实给予　脑缺血鼠Ｇ—ＣＳＦ能够在脑梗死区域内引起新的　神经和血管形成，减弱组织损害，减少梗死体积和　提高神经功能，原因可能为脑缺血时细胞大量坏　死，而一种名为ＳＤＦ一１／ＣＸＣＲ４的蛋白质会大量　合成释放出来，将周围血中的干细胞吸引至脑部，　修补受损细胞　。　应用Ｇ—ＣＳＦ动员自体骨髓干细胞治疗重型　颅脑损伤，更符合机体自身的反应性修复机制，方　法简便且可完全避免异基因移植的免疫排斥反　应。本研究在临床上共观察６０例患者，其中实验　组３０例，对照组３０例，结果表明，治疗１个月时　实验组ＧＣＳ评分较对照组略有改善，但差异无显　著性，随访３个月、６个月时ＧＣＳ评分较对照组均　明显升高，差异有显著意义。且６个月时实验组　神经功能缺损评分较对照组明显改善。实验组患　者外周血ＣＤ３４　、ＣＤ１３３　细胞随时问推移逐渐　升高，到第３天时均达到峰值，与２００６年报道提　前２天　］，这可能由于脑损伤所致的应急反应能　够动员骨髓干细胞人血。实验组治疗后６个月受　的，其能通过血脑屏障到达受损伤脑区域在其局　部微环境下分化为神经元并参与神经修复且需要　一段时间。３０例实验组患者，有１例出现轻微呼　吸困难，１例出现皮诊，均给予抗过敏药物注射后　缓解，其余患者均无不良反应，无白细胞栓塞事件　发生及骨髓增生异常表现。　参考文献　１曹新巧，张苏明．骨髓间充质干细胞与基因治疗应用．卒　中与神经疾病，２００３，１０（６）：３８０　２　Ｍｔｉｌｌｅｒ—Ｈａｒｔｍａｎｎ　Ｗ，Ｈｅｒｍｉｎｇｈａｕｓ　Ｓ，Ｋｒｉｎｇｓ　Ｔ，ｅｔ　ａ／．　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｎ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｌ℃ｓｏ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ　ｎａｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｍａｓｓ　ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｍ－　ｄｉｏｌｏｇｙ，２００２；４４（５）：３７１　３全国第四届脑血管病学术会议．脑卒中患者临床神经功　能缺损程度评分标准（１９９５）．中华神经科杂志，１９９６；２６　（６）：３８１　４　Ｍｅｚｅｙ　Ｅ，Ｋｅｙ　Ｓ，Ｖｏｇｅｌｓａｎｇ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｇｅｎｅｒａｔｅｓ　ｎｅｗ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｉｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３；１００（３）：１３６４　５　Ｋｏｃｈｅｒ　ＡＡ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ　ＭＤ，Ｓｚａｂｏｌｃｓ　ＭＪ，ｅｚ　ａ／．Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ－　ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ・—ｍａｒｒｏｗ——　ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ　ｐｒｅｖｅｎｔｓ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ｒｅ—　ｄｕｃｅｓ　ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｃａｒｄｉａｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ　Ｍｅｄ，　２００１；７（４）：４３０　６　Ｓｃｈａｂｉｔｚ　ＷＲ，Ｋｏｌｌｍａｒ　Ｒ，Ｓｃｈｗａｎｉｎｇｅｒ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｕｒｏｐｒｏ－　ｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　ｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ａｆｔｅｒ　ｆｏｃａｌ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｓｔｒｏｋｅ，２００３；３４（３）：７４５　７　Ｓｉｘ　Ｉ，Ｇａｓａｎ　Ｇ，Ｍｕｒａ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｈａｒｍａ—　ｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｅｒｅ—　ｂｒｌａ　ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００３；４５８（３）：３２７　８　Ｓｈｙｕ　ＷＣ，Ｌｉｎ　ＳＺ，Ｙａｎｇ　ＨＩ，ｅｔ　ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ　ｒａｔｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｇｒａｎｕｌｃｏｙｔｅ　ｃｏｌｏｎｙ—　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃ・－　ｔｏｒ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ—ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００４；１　１０（１３）：　１８４７　９　Ｓｐｆｉｇｇ　Ｎ，Ｂａｔｈ　ＰＭ，Ｚｈａｏ　Ｌ，ｅｌ　ａ１．Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ—ｃｏｌｏｎｙ—　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｅｍ　ｅｅｌｓ　ｉｎ　ｐａ－　ｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｓｕｂａｃｕｔｅ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｓｔｒｋｅ．Ｓｒｏｋｅ．２０ｏ６；３７：２９７９　（收稿：２０１０—０５—１３修回：２０ｌＯ—０５—２４）