酵母菌絮凝的分型及其生理生化特性的研究

＠　一ｓ３２－　３９卷６期　微　生　物　学　报　３９　Ｎｏ　６　１９９９年１２月　Ａｃｔａ　Ｍｉｃｍｂｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１９９９　酵母菌絮凝的分型　其生理生化特性的研究Ｔ＆钍。．ｉ　越　铁翠娟　何秀萍　谭华荣　摘要通过对４１０余株酵母菌进行絮凝测定．从中筛选到５株强絮凝菌。依据不同糖对其　絮凝水平的抑制，将５株强絮凝菌分为Ｆｌｏ　１型和ＮｅｗＦＩｏ型　对这两种絮凝型菌株的相关生　理生化特性进行了研究。结果表明，Ｆｌｏ　１型菌絮凝只受甘露糖抑制，它对高温（７０℃）、蛋白　酶Ｅ、胰蛋白酶敏感，而对蛋白酶Ｋ、廉蛋白酶、Ｃａ２一、ｐＨ有一定耐受性。ＮｅｗＦｌｏ型菌絮凝受　甘露糖等多种糖抑制，它对高温（７０℃）、各种蛋白酶、Ｃａ２　、ｐＨ均较敏感。这两种类型菌株絮　凝的最适Ｃａ２　浓度为１０ｍｍｏ［／Ｌ－－ｌｍｏ［／Ｌ，最适ｐＨ为３．０－－４　５。　关键词　兰兰　．墅，盐丑，生里圭　堑堡．簟醇ｌ啦．　分类号Ｑ０３９．５文献标识码Ａ文章编号０００１．６２０９（１９９９）０６，０５２７．３２　酵母菌絮凝通常指酵母菌在生长期间发生的细胞间的无性凝集。在发酵工业中，酵　母菌细胞的絮凝能力是评价菌种优劣的一个重要指标。若细胞絮凝性强，在发酵后期，分　散于发酵液中的细胞相互聚集形成絮凝颗粒并沉降，从而有利于细胞同发酵液的有效分　离，可大大简化后处理工艺，降低成本。然而絮凝是一个极复杂的现象，不仅受遗传因子　的控制，而且受环境、生理等多方面的影响。目前，对酵母菌絮凝机理还不太清楚．主要有　两种假说　Ｊ：一种假说认为酵母菌细胞絮凝是由细胞壁上类外源凝集素的糖蛋白和甘露　聚糖相互作用形成；而另一种假说认为酵母菌细胞絮凝是细胞壁上蛋白和甘露聚糖间以　钙离子桥连接而成。近年来，国外有关学者对酵母菌絮凝机理及其分子遗传学进行了较　广泛的研究　Ｊ，而国内未觅类似报道。本文报道了强絮凝酵母菌的筛选、分型及其生　理生化特性的研究结果。　－　１材料和方法　Ｉ，Ｉ材料　Ｉ．Ｉ．Ｉ菌株：从本组保藏的酵母菌中挑选出不同种属的４１０余株菌作为筛选强絮凝菌的　出发菌株，编号为ＦＬＩ～ＦＬ一４１０。标准Ｆｌｏ　Ｉ型絮凝菌株ＡＢＸＬ－１Ｄ（ＭＡＴ　ａ，ＦＬＯ１），　ＢＸ２４—２Ｂ（ＭＡＴ　，ＦＬＯ１），ＡＢＸＲ－１１Ａ（ＭＡＴｃ￣，ＦＬＯ５），ＳＴＸ３４７—２Ｃ（ＭＡＴ　，ＦＬＯ５）由美国　的Ｒｅｂｅｃｃａ　Ｃｏｎｔｏｐｏｕｌｏｕ教授赠送。标准ＮｅｗＦｌｏ型絮凝菌株ＮＣＹＣｌｌ９０，ＮＣＹＣｌ１９５由　英国的Ｊ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ教授赠送。　１．１．２培养基：ＹＥＰＤ培养基，ＹＮＢ培养基，麦芽汁培养基　・。　１．１．３酶、试剂及溶液：各种蛋白酶均为国产。所用化学试剂为分析纯。絮凝缓冲液为　０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠缓冲液（ｐＨ４．０，含１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａａ２））。蛋白酶的缓冲液为０．１ｍｏｌ／Ｌ　收稿日期：１９９８　０３．０２，修回日期：１９９８４）５．２７　维普资讯 http://www.cqvip.com

微　生　物　学　报　３９卷　磷酸钠缓冲液（ｐＨ７．５）。　１．２培养条件和测定方法　１．２．１培养条件：实验菌株于２５℃活化后接一环于液体ＹＥＰＤ中，２５＂１２，２００ｒ／ｒａｉｎ培养　４８ｈ。　１．２．２絮凝水平测定：按文献［６］的方法略有改进。目测法：将待测菌接种于装有３ｍＬ　ＹＥＰＤ液体培养基的试管中，２８℃静置培养４８ｈ后，剧烈振荡ｌｍｉｎ，室温静置，观察絮凝　形成速度及絮凝物大小，确定菌株的絮凝水平。分光光度法：取４８ｈ培养物离心收集菌　体，用２５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ溶液及无菌水各洗两次，离心收集菌体并悬于絮凝缓冲液中，　立刻在６０Ｏｎｔｏ处测０１）值；然后细胞悬液移至三角瓶中，２５℃，１２０ｒ／ｍｉｎ振荡２ｈ至絮凝　完成，室温静置３０ｍｉｎ，取上清在６００ｎｍ处测ＯＤ值。以振荡处理后测定的０１）值除以　振荡处理前测定的ＯＤ值，再乘以１００％（即自由细胞浓度）表示絮凝水平。　１．３不同因素对菌株絮凝水平的影响　１．３．１不同糖对絮凝水平的影响＿６　：将不同浓度的各种糖溶于絮凝缓冲液中，测定絮凝　水平，为避免代谢旺盛的酵母细胞消耗糖而降低其浓度，可于２５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ洗细胞　时，在６０℃处理５ｍｉｎ以杀死细胞（该处理不影响细胞的絮凝），然后测定絮凝水平。　１．３．２　Ｃａ２　浓度对絮凝水平的影响”Ｊ：改变絮凝缓冲液中ｃａ　的浓度，测定絮凝水平。　１．３．３　ｐＨ值对絮凝水平的影响：改变絮凝缓冲液的ｐＨ值，测定絮凝水平。　１．３．４高温对絮凝水平的影响：将用ＥＤＴＡ及蒸馏水洗过的酵母细胞重新悬于絮凝缓　冲液中，７０℃保温，在不同时间取样，测定絮凝水平。　１．３．５蛋白酶对絮凝水平的影响：将用ＥＤＴＡ及蒸馏水洗过的酵母细胞重新悬于加有　各种蛋白酶的０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸钠缓冲液（ｐｈ７．５）中，３０℃保温，在不同时间取样，测定絮凝　水平。蛋白酶浓度分别为：蛋白酶Ｅ　０．１ｍｇ／ｍＬ，蛋白酶Ｋ　ｌｍｇ／ｍＬ，胰蛋白酶ｌｍｇ／ｍＬ，　糜蛋白酶０．５ｍｇ／ｍＬ。　１．３．６培养基对絮凝水平的影响：将酵母菌分别接种于ＹＥＰＤ培养基、ＹＮＢ培养基、麦　芽汁培养基中，２５＂１２，２００ｒ／ｒａｉｎ培养４８ｈ，测定絮凝水平。　１．３．７培养时间对絮凝水平的影响：将酵母菌接种于ＹＥＰＤ培养基后，每隔８ｈ取样测　定絮凝水平。　２结果和分析　２．１强絮凝菌株的筛选　通过目测法从酵母菌ＦＬ１～ＦＬ４１０中筛选到５株强絮凝菌株，即ＦＬ一１８６、ＦＬ一１８７、　ＦＬ一１８９、ＦＬ一１９０、ＦＬ一１９１，均为啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。用这５株菌进行后续　实验。　２．２絮凝菌株的分型　Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ等人将酵母菌絮凝表型分为两型：Ｆｌｏｌ型和ＮｅｗＦｌｏ型，Ｆｌｏｌ型菌絮凝只受　甘露糖抑制，而ＮｅｗＦｌｏ型菌絮凝受甘露糖等多种糖抑制。本文检测了ｉｍｏｌ／Ｌ不同搪　（甘露搪、麦芽搪、葡萄糖）对５株强絮凝菌的絮凝水平抑制情况，并以标准絮凝菌株作对　照。结果表明ＦＬ一１８９、ＦＬ－１９０、ＦＬ一１９１的絮凝仅受甘露糖抑制，而不受其它糖的影响，与　维普资讯 http://www.cqvip.com

６期　张博润等：酵母菌絮凝的分型及其生理生化特性的研究　标准Ｆｌｏ　１型菌株的表型一致，该特性表明这３株菌属于ＦＩｏ　１型。而ＦＬ一１８６、ＦＬ一１８７的　絮凝则受以上３种糖不同程度的抑制，与标准ＮｅｗＦ｜ｏ型菌株的表型一致，证明这两株菌　属于ＮｅｗＦ１０型。据文献　报道，Ｆｌｏ　１型菌可能同基固ＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ８、Ｃｙｃ８、Ｔｕｐｌ　有关。分型结果见表１。　表１絮凝菌株的分型　Ｔａｂｌｅ　１　Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｆｌ￣ｃｕｌｅｎｔ　ｐｈｅｔｔｏｔｙｐ￣　注：“一”不絮凝；“＋”弱絮凝；“＋＋“中度絮凝；“＋＋＋”强絮凝　“一”Ｎｏ　ｆｌｏ￣ｔｄａｔｉｏａ；“＋　Ｐｏｏｒ　ｆｌ￣ｅａ／ａｄｏｎ；“＋＋”ｍｅｄｉａｌ　ｆｌｏｃｃｕ／ａｔｉｏｎ；　＋＋＋”Ｓｔｒｏｎｇ　ｆＩ￣ｅｕｌａｔｉｏｎ．　２．３不同因素对菌株絮凝水平的影响　２，３．１糖浓度对絮凝水平的影响：结果如图１　所示。不同浓度的糖对ＮｅｗＦｌｏ型菌的絮凝均　有抑制作用，且随糖浓度增高，抑制作用加强。　其中麦芽糖的抑制作用最强，浓度仅为　１００ｍｍｏｌ／Ｌ时就几乎完全抑制絮凝；葡萄糖的　抑制作用最弱，当浓度升高至ｌｍｏｌ／Ｌ时才能完　全抑制絮凝。Ｆｌｏ　１型菌的絮凝则只受甘露糖　抑制，抑制作用随糖浓度增加而缓慢增强。　２．３．２　Ｃａ２　对絮凝水平的影响：结果如图２所　示，可以看出，Ｆｌｏ１型和ＮｅｗＦｌｏ型菌株的絮凝　都依赖Ｃａ２　。最适Ｃａ２　浓度为ｌＯｍｍｏｉ／Ｌ～　图１糖浓度对絮凝的影响　Ｆｉｇ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｕｇａｒ　ｃｏｔｔｏｅａｔｒａｔｉ￣ｎ［ｍｔｈｅ　１，０ｍ。ｌ／Ｌ，且ＮｅｗＦｌｏ型菌对Ｃａｚ　浓度变化较　ｌｆｏｏｃｕｌａｆｉｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｃｅｉｌｓ　ＦＩ。１型菌敏感，当Ｃａ　浓度低于１０ｍｍｏｌ／Ｌ或　●｝Ｍａｎｎｏ￣；‘：Ｍａｉｔｒｅ；■　Ｇ［ｕｃｃ￣ｅ；　高于２．０ｍｏｉ／Ｌ时即表现出较明显的絮凝抑制。　ＦＬ　１８６；一：ＦＬ．１９１．　２．３．３　ｐＨ对絮凝水平的影响：实验结果表明Ｆｉｏ　１型和ＮｅｗＦｌｏ型菌株的絮凝都依赖　ｐＨ（图３）。最适ｐＨ为３，０－－４，５。同Ｃａｚ　对絮凝的影响相似，ＮｅｗＦｌｏ型菌对不同ｐＨ值　都较Ｆｌｏ　ｌ型菌敏感。　２．３．４高温对絮凝水平的影响：实验结果表明Ｆｌｏ　１型和ＮｅｗＦｌｏ型菌株的絮凝均受高　温（７０＂Ｃ）抑制（图４），且温育时间越长，对细胞絮凝抑制越明显。这可能是由于参与絮凝　形成的细胞壁表面蛋白在高温时失活，空间结构发生改变，从而使絮凝受抑制。　维普资讯 http://www.cqvip.com

微　生　物　学　报　３９卷　图２　ｃａ２　对絮凝的影响　Ｆｉｇ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ￣ｌｅｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｆｌｏｅｃｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｔ　ｃｅｉｌｓ　■：ＦＬ一１８６；　：ＦＬ．１８７；口：ＦＬ－１９１；　：ＦＬ－１８９　承　童　蠹　盖　１　２　，４　５　６　ｐＨ　图３　ｐＨ对絮凝的影响　图４高温（７０℃）对絮凝的影响　Ｆ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｌ￣ｕｌａｔｉｏｎ　Ｆ　４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍ４）ｅ￣ｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｅｄｌｓ　ｌｆ￣ｕｈ６ｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｅｄ［ｓ　●：ＦＬ－Ｉ８６；ＡＦＬ－１８７；口：ＦＬ－１９０；　：ＦＬ－１８９　■：Ｆｌ，１８６；ＡＦＬ－１８７；口：ＦＬ－１９０；　：ＦＬ－１８９　２．３．５不同蛋白酶对絮凝水平的影响：如图５所示，ＮｅｗＦｌｏ型菌对蛋白酶Ｅ、蛋白酶Ｋ、　胰蛋白酶相当敏感，仅作用１０ｒａｉｎ就几乎完全丧失絮凝性。对糜蛋白酶则有一定耐受性，　随温育时间延长絮凝逐渐减弱，至６０ｒａｉｎ时才几乎不絮凝。Ｆｌｏ　ｌ型菌对蛋白酶Ｅ、胰蛋　白酶也较敏感，温育１０ｍｉｎ后即丧失絮凝性．但对蛋白酶Ｋ及糜蛋白酶均有一定耐受性，　随温育时间延长絮凝只缓慢减弱。蛋白酶对絮凝有抑制作用表明细胞壁蛋白参与絮凝形　成。由于Ｆｌｏｌ型和ＮｅｗＦｌｏ型菌株对四种蛋白酶的敏感性不同，表明这两种絮凝型菌株　的细胞壁表面参与絮凝形成的蛋白组成可能不同。　２．３．６培养基对絮凝水平的影响：我们测定了Ｆｌｏ　ｌ型和ＮｅｗＦｌｏ型菌株在不同培养基　中培养后细胞的絮凝水平．结果表明Ｆｌｏ　ｌ型菌株在ＹＮＢ、ＹＥＰＤ中培养较在麦芽汁中培　养絮凝水平高，而ＮｅｗＦｌｏ型菌株在麦芽汁、ＹＮＢ中培养较在ＹＥＰＤ中絮凝水平高。　维普资讯 http://www.cqvip.com

６期　张博润等：酵母菌絮凝的分型及其生理生化特性的研究　星　煮　盖　２０　４０　６０　图５蛋白酶对絮凝的影响（Ａ蛋白酶Ｅ，Ｂ胰蛋白酶，Ｃ蛋白酶Ｋ，Ｄ糜蛋白酶）　Ｆｉｇ　５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｐｒｏｔｅ￣Ｄｎｔｈｅ　ｎｏｃｃ山ｔ１蚰０ｆ　ｖ咖ｃ　ｕｓ　（Ａ　ｌ￣ｏｔｅａｓｅ　Ｅ，Ｂ　Ｔｒｙｐｓａｓ￣，Ｃ　Ｐｒｏｔｅ０ｓ￣Ｋ　Ｄ　Ｃｈｙｍｏｗｙｐｓ［ｎ）　■：ＦＬ．１８６；‘：ＦＬ－１８７；口：ＦＬ－１９１；　：ＦＬ　１８９　２．３．７培养时间对絮凝水平的影响：实验结果表明Ｆｌｏ　１型菌株在整个培养期间都具絮　凝性，即所谓结构性絮凝。而ＮｅｗＦｌｏ型菌只是到稳定期才开始出现絮凝。　３讨论　本文通过对４１０余株酵母菌进行絮凝水平能力测定，从中筛选到５株强絮凝菌株。　依据不同糖对其絮凝的抑制作用不同，将５株强絮凝菌株分为Ｆｌｏ　１型和ＮｅｗＦｌｏ型。实　验了不同物理、化学因子对这两种絮凝型菌株的絮凝表型的影响，对酵母菌的絮凝机理作　了初步探索。结果表明，酵母细胞絮凝是ｃａ２　依赖的，且有细胞壁蛋白和甘露聚糖的参　与。然而，对于不同絮凝型菌株，可能这三种因子所起的作用不同，有可能这两种絮凝型　菌株的絮凝机理分别属上述两种絮凝假说之一，还需进一步深入研究。　据文献ｌ８　报道，可根据菌株絮凝性对高温和糜蛋白酶的敏感性不同将Ｆｌｏ　ｌ型菌株　分为两大类：对高温（７Ｏ℃）敏感而对糜蛋白酶不敏感的ＦＩｏ　１型菌株可能带有ＦＬＯ５基　维普资讯 http://www.cqvip.com

５３２　微　生　物　学　报　３９卷　因；对高温（７Ｏ℃）不敏感而对糜蛋白酶敏感的Ｆｌｏ１型菌株可能带有ＦＬ０１基因。本实验　结果表明我们筛选到的Ｆｌｏ　１型菌株对高温（７０℃）和糜蛋白酶都有不同程度的敏感性，　仅对高温和糜蛋白酶的敏感性难以确定Ｆｌｏ　１型菌株带有何种絮凝基因。故还需进一步　对这些Ｆｌｏ　ｌ型菌株进行分子生物学方面的深入研究，才能确定絮凝基因和絮凝表型的　相关性。　参［１］　张博润．任考文献　健．刘玉方微生物学通报．１９９６，２３（５）：３０７～３１１　Ｙｅａｓｔ　１９９４　１０：２１１～２２５　［２　Ｊ　Ｗａｔａｒｉ】，Ｔａｋａｔａ　Ｙ　Ｏｇ￣ｗａ　Ｍ　ｅｔ　【３』Ｄｅｎｇｌｓ　Ｐ　Ｂ，Ｉｎｓｔ　Ｂ一，１９９７　１０３【４】：２５７～２６２　［４］　Ｂｏｎｙ　Ｍ，Ｔ　ｎｅｓ－ｓｅｍｐｏｕｘ　ｄ，Ｂｏｒｒｅ　Ｐ　ａｌ　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｃｄ．１９９７，１７９（１５）：４９２９～４９３６．　［５］　贾盘　，蔡金科，马薄钦等微生物遗传学实验技术，科学出版社，１９９２，４０７～４０８　【６　Ｊ　Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ　Ｍ，Ａ黜ｍｄｅｒＳ　Ｙｅａｓ￣，１９９１，７：５５９～５７４　【７］ＤｅｎｇｉｓＰ　ｂ，Ｎｅｌｉｓｓｅｎ　ＬＲ，Ｒｏｕｘｈｅｔ　ＰＧ　ＡｐｐｌＥｎｖｉ￣ｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ　１９９５，６１（２）：７１８～７２８　　ｌ８　ｌ　Ｂｉｄａｒｄ　Ｂ　Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｌ，１９９４，２５：１９６～２０１　ＤＩＳＴＩＮＣＴ１０Ｎ　０Ｆ　ＹＥＡＳＴ　ＦＬ０ＣＣＵＬＥＮＴ　ＰＨＥＮＯＴＹＰＥＳ　ＡＮＤ　ＳＴＵＤＩＥＳ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＰＨＹＳＩｏＬｏＧＩＣＡＬ　ＡＮＤ　Ｂ１０ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ　０Ｆ　ＹＥＡＳＴ　ＦＬ０ＣＣＵＬ　ＴＩｏＮ　Ｚｈａｎｇ　Ｂｏｎｍ　Ｃｈｅｎ　Ｗｅｉ　Ｔ｜ｅ　Ｃｕｉｊｕａｎ　Ｈｅ　Ｘｉｕｌａｌｎｇ　１ｈ　Ｈｕａｒｏｎｇ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　￡ｔ—Ａｃａｄｍｎｙ　ｏｆ＆　∞．Ｂｅｌｉｎｇ　１０００８０）ｔ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　４００　ｙｅａｓｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅｉｒ　ｆｌｏｃｃｕｈｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｆｉｖｅ　ｏｆ　ｔｈｅｍ　ｄｉｓ—　ｐｌａｙｅｄ　ｓｔｒｏｎｇ　ｌｏｆｃｃｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　５　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｇｍｕｐｅ　ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　Ｆｌｏ　１　ａｎｄ　ＮｅｗＦｌｏ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓｕｇａｒ　ｉｎｈｉｉｔｏｎ．Ｒｅｌｈａｔｅｄ　ｐｈｙｓｏｌｏｇ￣ｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ＇ｕｃｇｏ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ’ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　Ｔｈｅ　ｍｓｄｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｌｏｃｃｄａｔｂｎ　ｏｆ　Ｆｌｏ　１　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｗａ５　ｏｎｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ｍＨＴ】Ｔｌ０ｓｅ；ｉｔ　ＷＳ．Ｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（７０＂Ｃ），　ｐｒｏｎａｓｅ　Ｅ，ｔｒｙｐｓｉｎ，ｗｈｅｒｅａｓ　ｔｏｌｅｒａｎｔ　ｔｏ　ｐｒｏｎａｓｅ　Ｋ，ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｅｉｎ，Ｃａｚ　。ｐＨ；ｔｈｅ　ｆｌｏｃｃｄａｔ￣ｎ　ｏｆ　ＮｅｗＦｌｏ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ｍａｎｙ　ｓｕｇａｒｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｇｌＵＣＯＳ￣，ｍａｌｔｏｓｅ．ｓｕｃｒｏｓｅ．ｎ∞ｎｒＫ　；ｉｔ　ｗｓｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔ　ｏ　ｉｇｈ　ｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（７０＂Ｃ），ｐｒｏｎａｓｅ。Ｃａ２　，ｐＨ　Ｔｈｅ　Ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｆｌｏｃｃｕｌａｔｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｌｏｌ　ａｎｄ　ＮｅｗＦｌｏ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ——　ｌｍｏｌ／Ｌ；３．０～４　５　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｙｅａｓｔｓ．ＦｌｃｃｕｌｏｕＬａｔｉｕｌｏｎ，Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，‘Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｌｉ—　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｆｉｓｔｉｃｓ