天山雪莲悬浮培养细胞中紫丁香苷、绿原酸和1,5―二咖啡酰奎尼酸的生物合成调控

酰奎尼酸的生物合成调控

[摘要]紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸为野生天山雪莲中的3种活性化学成分，具多种药理活性，在药材中含量较低。研究在筛选得到天山雪莲上述3种化学成分高产细胞系的基础上，通过外源添加碳源和生物合成前体的方法调控紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸在天山雪莲培养细胞中的生物合成，极大地提高了其含量和产量。仅需培养16 d，紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的质量浓度即可以分别达到339.0，225.3，512.7 mg?L-1；三者的含量分别为野生药材的67.9，1.9，10.6倍。研究为最终实现通过天山雪莲细胞培养同时规模化生产以上3种活性成分打下了坚实基础，具有理论和实际应用意义。

[关键词]天山雪莲；紫丁香苷；绿原酸；1，5-二咖啡酰奎尼酸；细胞悬浮培养；生物合成调控

天山雪莲Saussurea involucrata，又名新疆雪莲，大苞雪莲，为菊科凤毛菊属Saussurea多年生草本植物，被历代医书奉为雪莲类药材的正品，用于治疗风湿性关节炎、肺寒咳嗽、闭经、胎衣不下、阳痿等疾患[1]，是一种极有开发和利用价值的传统药材。由于长期以来对雪莲的掠夺性采挖，加

上自然环境中繁殖困难，生长缓慢，野生天山雪莲已处于濒危的境地，属国家二级濒危保护植物，野生天山雪莲资源已难以满足临床药用开发的需求。植物组织细胞培养等生物技术手段的发展可为天山雪莲中活性次级代谢产物的生产提供切实可行且可持续利用的途径，如已报道的有通过天山雪莲细胞培养生产黄酮[2-3]，通过发状根培养生产紫丁香苷[4]，通过组培苗生产紫丁香苷和芦丁[5]。

紫丁香苷（syringin）、绿原酸（chlorogenic acid）和1，5-二咖啡酰奎尼酸（1，5-dicaffeoylquinic acid）为野生天山雪莲中的3种活性化学成分，但含量较低，本研究组前期筛选得到1株可以同时高产该3种成分的天山雪莲细胞系，并对其化学成分进行了系统的分离分析[6-8]。据报道，紫丁香苷具有抗炎镇痛[9]、抗高血糖[10]、抗抑郁[11]及抗癌[12]活性，在《中国药典》中被规定为天山雪莲、刺五加等药材以及相关制剂的定性和定量指标。绿原酸具有抗炎[13]、抗高血糖[14]和抗乙型肝炎病毒作用[15]，被认为是众多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分。1，5-二咖啡酰奎尼酸具有很好的抗氧化[16] 、治疗糖尿病[17]和抗艾滋病[18-19]作用。综上所述，紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸具有多种药用活性，具有重要应用价值。目前该3种物质的主要来源仍为从野生植物中提取，然而，除绿原酸在菊科、忍冬科植物中分布较广、含量较高外，其他2种物

质在植物中分布少、含量低，且往往与多种同系物及其他类型次级代谢产物一同混合存在，分离纯化较为困难。本研究在筛选得到天山雪莲高产细胞系的基础上，通过外源添加碳源和生物合成前体的策略调控紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸在天山雪莲培养细胞内的生物合成，极大地提高了以上3种成分的含量和产量，为最终实现通过天山雪莲细胞培养同时规模化生产以上3种活性成分打下坚实基础，具有理论意义和实际应用前景。 1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 培英HYG-A全温摇瓶柜（太仓市实验设备厂）；YT-CJ-2ND型洁净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）；Agilent 1200分析型高效液相系统及Agilent LC系统化学工作站（Agilent，Germany）；超声提取用10200A型超声波清洗器（AUTO SCIENCE，Canada）。

紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸对照品为本研究组从天山雪莲培养细胞中分离得到，并经1H-NMR，13C-NMR，MS进行了结构确证[7-8]，面积归一化法显示以上对照品纯度均为98%以上。色谱级乙腈和甲醇（Merck，Germany）；色谱级磷酸（Mreda，USA）；L-苯丙氨酸（Amresco，USA）；NAA，6-BA，2，4-D（Sigma-Aldrich，USA）。细胞培养实验中所用其他试剂均为分析纯。

1.2 材料来源 天山雪莲培养细胞诱导自采自新疆天山

地区的野生天山雪莲成熟种子萌发得到的无菌苗的叶片，结合次生代谢成分分析反复筛选1年以上得到稳定高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞系。 1.3 细胞悬浮培养 细胞悬浮培养物于黑暗（25±2） ℃摇瓶旋转振荡培养。采用附加植物生长调节剂α-NAA（α-萘乙酸）0.5 mg ?L-1，6-BA（6-苄基嘌呤）0.5 mg ?L-1和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）0.2 mg ?L-1以及30 g?L-1蔗糖的MS液体培养基，灭菌前调pH为5.8。以500 mL锥形瓶为培养容器，培养基装量为125 mL，每升培养基接种量为50～60 g鲜重细胞，摇床转速为110 r?min-1，培养14～16 d收获。 1.4 碳源和前体的添加 以蔗糖为碳源，考察不同浓度的蔗糖对天山雪莲培养细胞生物量及目标成分含量和产量的影响。蔗糖添加于初始培养基中，终浓度分别为10，20，30，50，80 g?L-1。在培养基中添加不同浓度的L-苯丙氨酸以考察外源添加生物合成的前体物质对培养细胞生物量及紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸3种成分含量和产量的影响。L-苯丙氨酸添加于初始培养基中，终浓度分别为0，50，200，500，1 000 mg?L-1。每个试验设3个平行实验。 1.5 天山雪莲细胞悬浮培养生物量及目标成分产量积累动态 采用附加0.5 mg ?L-1 NAA，0.5 mg ?L-1 6-BA，0.2 mg ?L-1 2，4-D，500 mg?L-1 L-苯丙氨酸和50 g?L-1蔗糖的MS液体培养基，培养条件同细胞悬浮培养，接种后每2 d随机取样

3瓶。测定细胞生物量及目标成分含量和产量。 1.6 细胞生物量的测定 减压抽滤分离培养液得到培养细胞，蒸馏水洗3遍，55 ℃烘干至恒重，称量得培养细胞的干重生物量（g?L-1）。

1.7 含量测定 取干燥至恒重的天山雪莲培养细胞，研细，过40目筛，精密称取细粉约100.0 mg，置于具塞试管中，用70%甲醇10 mL超声提取15 min，用甲醇补足失重，0.45 μm滤膜过滤，通过HPLC同时测定紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量。Shiseido capcell pak C18 MGⅡ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.2%磷酸缓冲盐溶液（含50 mmol?L-1 KH2PO4），流动相B为乙腈，梯度洗脱。梯度条件：0 min（VA∶VB=92∶8）～20 min（VA∶VB=90∶10）～50 min（VA∶VB=70∶30）～60 min（VA∶VB=50∶50）；流速 1.0 mL?min-1；柱温 30 ℃；检测波长 265 nm（紫丁香苷）、327 nm（绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸）双波长同时记录；进样量 10 μL；每针分析间采用初始流动相平衡10 min。紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸分别在10.4～208，12.2～244，10.5～210 mg?L-1，对照品峰面积Y与对照品质量浓度X（mg?L-1）呈良好的线性关系。

回归曲线方程及相关系数如下：紫丁香苷Y = 21.701 8X+23.4713，r=0.999 6；绿原酸Y=30.251 5X + 36.105 9，

r=0.999 8；1，5-二咖啡酰奎尼酸Y=37.338 8 X+66.562 1，r=0.999 8。 2 结果与讨论

2.1 碳源对天山雪莲悬浮培养细胞生物量和目标成分产量的影响 碳源是植物培养细胞生长的必需成分，而蔗糖是植物细胞培养培养基的最常用碳源，其除了作为细胞生长的能源外，对调节培养体系的渗透压也起重要作用。虽然MS培养基所推荐的蔗糖质量浓度为30 g?L-1，培养基中添加蔗糖在10～50 g?L-1，随着蔗糖浓度的增加天山雪莲培养细胞生物量接近线性增长，而随着蔗糖浓度的进一步增加，细胞生物量增加趋缓，见图1。另一方面，培养基中添加高浓度蔗糖可以显著提高培养细胞中紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量以及每升培养基中3种成分的产量。每升培养基中添加50 g蔗糖最有利于3种目标成分的积累，与每升培养基添加30 g蔗糖相比，虽然每升培养基生物量增长了接近1倍，但紫丁香苷的每升培养基产量却增加了7倍，并且每升培养基添加30 g蔗糖时产量较低的绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸得到了大量的积累。究其原因，可能是由于高蔗糖浓度使培养体系的渗透压增加，培养细胞产生胁迫反应从而大量合成紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸3种次级代谢产物，见图1。因此，本研究优选每升培养基中添加50 g蔗糖用于提高天山雪莲悬浮培养细胞生物量以及

目标成分的含量和产量。

2.2 生物合成前体物质对天山雪莲悬浮培养细胞生物量和目标成分产量的影响 紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸均为苯丙烷类化合物，在生物体内由肉桂酸途径合成，通过人工添加生物合成的前体物质有可能提高该3种成分的产量。本研究前期考察了在培养基中添加不同前体物质，如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和肉桂酸（0～1 000 mg?L-1），对天山雪莲悬浮培养细胞生物量及细胞内次级代谢产物积累的影响，发现一定浓度的L-苯丙氨酸并不对培养细胞的生长产生明显影响，却明显提高多种次级代谢产物的产量；L-酪氨酸的添加对细胞生长和次级代谢产物的产量影响均不明显，而肉桂酸的添加显著影响细胞的生长，容易引起培养细胞的褐化及死亡。

由此，本部分研究着重考察在培养基中添加不同浓度的L-苯丙氨酸对天山雪莲悬浮培养细胞生物量及紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸含量和产量的影响。结果发现在每升培养基中添加0～500 mg的L-苯丙氨酸几乎不对细胞生物量产生明显影响，当L-苯丙氨酸达到每升培养基1 000 mg时对细胞生长产生抑制；L-苯丙氨酸的添加对紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸含量及产量的影响并不完全一致，每升培养基中添加500 mg的L-苯丙氨酸能较大地提高细胞中紫丁香苷的含量，相当于未添加L-苯丙氨酸时的

12.8倍，为添加200 mg L-苯丙氨酸时的8.1倍，见图2。由于L-苯丙氨酸对生物量的影响较小，紫丁香苷含量的增加是其产量增加的主要原因。然而，L-苯丙氨酸的添加对细胞中绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸含量及产量的影响并不十分明显，每升培养基中添加200 mg的L-苯丙氨酸时绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量较高，分别为添加500 mg的L-苯丙氨酸时的1.3，1.7倍。由于每升培养基中添加500 mg的L-苯丙氨酸相对于200 mg能显著提高细胞中紫丁香苷的含量，而以上2个浓度下绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量变化并不显著，综合L-苯丙氨酸对悬浮培养细胞生物量及紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸含量及产量的影响，本研究优选每升培养基中添加500 mg的L-苯丙氨酸用于提高目标成分的含量和产量，见图2。 2.3 优选培养条件下天山雪莲悬浮培养细胞生长和目标成分积累动态 次级代谢产物在细胞内的积累是一个动态的过程，详细了解目标成分在培养过程中的积累动态可以针对性选择最佳的收获时机，以获得最大产量的目标代谢产物。在每升培养基添加蔗糖50 g和L-苯丙氨酸500 mg的优选培养条件下对天山雪莲悬浮培养细胞生物量及紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸产量的积累动态进行考察发现，该细胞系生长迅速，生长周期短，随着培养时间的增加每升细胞生物量迅速增加，培养至第14天达到25.92 g，并开始进入平台

期；紫丁香苷的产量在培养的第16天达到最大，质量浓度为339.0 mg?L-1；绿原酸的产量在培养的第14天达到最大，质量浓度为311.3 mg?L-1，而培养到第16天绿原酸的产量开始下降，质量浓度为225.3 mg?L-1；1，5-二咖啡酰奎尼酸的产量在培养的第16天达到最大，质量浓度为512.7 mg?L-1，见图3。选择在培养的第16天收获细胞，紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量分别为野生药材的67.9，1.9，10.6倍，见表1。 3 结论

植物细胞具有全能性，即一个植物细胞具有与亲本植物完全相同的遗传信息，其不但具有发育成完整植株的能力，并且具有整株植物所具有的合成次级代谢产物的能力，因此，通过植物细胞培养可以获得亲本植物的药用活性成分，可以为药用活性成分的生产提供新的途径。紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸均为天山雪莲药材所具有的活性成分，具有多种明确药用活性，但含量较低。利用天山雪莲细胞悬浮培养并通过体外方法调控紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸在细胞内的生物合成，可以同时大量生产3种目标活性成分，而且利用生物体内酶反应的特异性避免了合成过程中多种异构体等副产物的生成，后续分离纯化容易，能为临床药用提供充足的资源。另外，通过植物细胞培养的方法生产药用活性成分产量高，周期短，不占用耕地，

不受地理位置和季节等的限制，不受病虫害的影响，不破坏生态环境，资源可持续利用，避免了野生资源的大量采挖，可以对珍贵的野生天山雪莲资源起到保护作用。 [参考文献]

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biosynthesis in cell suspension cultures of Saussurea involucrata

CHEN Ri-dao1，LIU Xiao1，ZOU Jian-hua1，YANG Lin2，DAI Jun-gui1*

（1.State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines，Institute of Materia Medica， Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China；

2. College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081，China） [Abstract] Syringin， chlorogenic acid and 1，5-dicaffeoylquinic acid are three main bioactive ingredients in herbs of Saussurea involucrata with various pharmacological properties， while their contents are very low. In this study， the biosynthesis of syringin， chlorogenic acid and 1，5-dicaffeoylquinic acid in the cell suspension cultures of S. involucrata were regulated by feeding carbon sources and precursors， which resulted in a great increase of the contents

and yields of the above three bioactive ingredients. After 16 days of fermentation， the yields of syringin， chlorogenic acid and 1，5-dicaffeoylquinic acid reached 339.0， 225.3， 512.7 mg?L-1， respectively. Meanwhile， their contents increased up to 67.9， 1.9， 10.6 times of wild medicinal material， respectively. The results provided a solid basis for further studies on application of cell suspension cultures of S. involucrata for large-scale production of bioactive compounds syringin， chlorogenic acid and 1，5-dicaffeoylquinic acid. [Key words] Saussurea involucrata； syringin；

chlorogenic acid； 1，5-dicaffeoylquinic acid； cell suspension culture； biosynthesis regulation doi：10.4268/cjcmm20141224