甘氨酸对新型胶原基人工骨材料细胞毒性影响的体外研究

维普资讯 http://www.cqvip.com Ｅ京口腔医学２００７年第１５卷第２期Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ　Ａｐｒｉｌ　２００７，Ｖｏ１．１５，Ｎｏ．２　甘氨酸对新型胶原基人工骨材料　细胞毒性影响的体外研究　刘星纲　邓旭亮　梅芳　吕培军　王新知　【摘要】　目的研究甘氨酸对新型胶原基人工骨材料的细胞毒性的影响。方法提取兔骨髓基质细胞，传至　第三代。在含或不含１０　Ｌ甘氨酸的培养液中与自行研发的胶原基人工骨材料共培养，定期计数存活细胞，另将　胶原基人工骨材料经甘氨酸处理或直接与第三代兔骨髓基质细胞复合，用扫描电镜观察细胞黏附情况。结果人　工骨材料组加入甘氨酸后的细胞贴壁数明显高于无甘氨酸组。扫描电镜观察甘氨酸处理后的人工骨表面有细胞　黏附，未处理组则无细胞黏附。结论甘氨酸可有效降低新型胶原基人工骨材料的细胞毒性。　【关键词】甘氨酸；细胞毒性；胶原交联　【中图号】　Ｒ７８３．１　【文献标识码】　Ａ【文章编号】　１００６￣７３Ｘ（２００７）０２－００７８－０３　Ａｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ｃｏＨａｇｅｎ－ｂａｓｅｄ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｌｙｃｉｎ　ＬＩＵ　Ｘｉｎｇ—ｇ８ｎｇ，ＤＥＮＧ　Ｘｕ—ｌｉａｎｇ，ＭＥＩ　，ＬＶ　Ｐｅｉ　ｊｕｎ，ＷＡＮＧ　ｎ—ｚｈｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｒｏｓｔｈｏｄｏｎｔｉｃｓ，Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｈｏｏｌ　ａｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８１，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｆｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｂａｓｅｄ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｌｙｃｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｂａｓｅｄ　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ａｕｔｈｏｒｓ　ｗａｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　１０ｇ／Ｌ　ｇｌｙｃｉｎ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ）ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｉｖｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｕｎｔｅｄ　ｏｎ　ｄａｙ　１，３，　５　ａｎｄ　７．Ｉｎ　ａｎｏｔｈｅｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅ　ｓｃｏｆｆｏｌｄ　ｗａｓ　ｆｉｒｓｔ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｌｙｃｉｎ　ｆｏｒ　３０　ｍｉｎ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ），ｏｒ　ｎｏｔ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｌｙｃｉｎ（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ），ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｂｏｔｈ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒａｂｂｉｔ　ｌＴｌａｆｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ａｔｔａｃｈｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｗａｓ　ｃａｃｕｌａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｌｉｖｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｌｙｃｉｎ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｎ—ｇｌｙｃｉｎ—　ｔｒｅａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｌｙｃｉｎ　ｈａｄ　ａ　ｌｏｗｅｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｇｌｙｃｉｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｇｌｙｃｉｎ　ｃａｎ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ—ｂａｓｅｄ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｇｌｙｃｉｎ；　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ—ｂａｓｅｄ　颌面部骨缺损在临床上多采用自体骨移植修　复。这种修复创伤大，费用高，且来源有限。近年来　各种人工骨材料尤其是可降解材料的研发给骨缺损　修复提供了新思路　Ｊ。胶原因其良好的可降解性　与生物相容性等诸多优点而广泛应用于人工骨的构　建中。然而天然胶原体内降解过快，为提高其抗降　解能力，改善机械性能，更便于临床操作，一般需要　将胶原交联改性后再使用。目前应用较广泛的交联　胞毒性尚需探讨。　甘氨酸是低分子量氨基酸，具有抑制微生物生　长、螯合、缓冲及抑制氧化的作用。消毒学中将其作　为戊二醛的中和剂，可有效拮抗戊二醛的细胞毒性，　甘氨酸及中和产物对细胞无明显不良影响。将其应　用于生物支架材料的改性尚需进一步实验６本研究　通过用甘氨酸降低自行研发人工骨材料的细胞毒性　的作用，为体外构建人工骨细胞复合体提供依据。　资料与方法　剂是戊二醛，它可显著提高胶原的抗降解能力及机　械性能　刮。但许多研究证实，经戊二醛交联后的胶　原具有一定的细胞毒性　’　，体外培养过程中难有　细胞黏附　ｊ，难与种子细胞体外复合后植入体内。　如何有效降低交联后的胶原在体外培养过程中的细　基金项目：８６３计划课题项目（Ｎｏ：２００４ＡＡ３０２Ｇ５０）　作者单位：１０００８１北京　Ｅ京大学口腔医学院・口腔医院修复科　［刘星纲（现为北京大学口腔医学院２００５级博士研究生）、邓旭亮、　Ｌ新型纳米磷酸三钙／胶、原（ｎａｎｏ—ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ　ｐｈ０ｓｐｈａｔｅ／ｃ０ｌｌａｇｅｎ，Ｎ．Ｔｃｐ／Ｃｏ）人工骨材料的制备：　与浙江大学材料化学学院合作研发出磷酸三钙／胶　原人工骨材料，呈海绵状。无机相磷酸三钙的大小　具有纳米级，有机相胶原采用戊二醛作为交联剂，以　增加降解时间。毒理试验，致畸致癌试验及细胞毒　性试验均经“北大医疗器械质量监督检验中心”检　测符合国家相关标准。将材料制成直径６　ｍｍ，厚度　１　ｍｍ的圆片备用。　吕培军、王新知］；北京大学医学部组胚教研组（梅芳）　通讯作者：王新知，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｎｚｗａｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ．ｃｎ，电话：０１０—　６２１７９９７７转２３４８　维普资讯 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京口腔医学２００７年第１５卷第２期Ｂｅｉｉｉｎｇ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ　Ａｐｒｉｌ　２ｏｏ７，Ｖ０１．１５。Ｎｎ　２　讨　论　不同组细胞培养计数结果显示，人工骨材料片　与兔骨髓基质细胞在单纯培养液中培养时，第３天　已经没有细胞存活，经统计学检验其差异有显著性，　说明人工骨材料具有一定的细胞毒性。培养液加入　１Ｏｇ／Ｌ甘氨酸后，人工骨材料片虽第１天时也表现　出一定的细胞毒性，但第３天开始到第７天，其细胞　数与甘氨酸＋培养液组相近，经统计学检验其差异　无显著性，但低于单纯培养液组，经统计学检验其差　异有显著性；证明１０ｇ／Ｌ的甘氨酸可有效拮抗人工　骨材料中戊二醛的细胞毒性，但需要至少１天后才　能显效，这可能是因为戊二醛与甘氨酸的反应需要　一定的时间；提示在与细胞体外复合之前，至少要与　１０ｇ／Ｌ的甘氨酸反应１天以上，３天左右的时间比较　可靠。扫描电镜的结果表明人工骨材料经过含　１０ｇ／Ｌ甘氨酸的培养液浸润处理可降低其细胞毒　性，有利于细胞黏附，这与细胞计数的结果一致。同　时我们也看到加入甘氨酸的２组细胞数均比空白组　细胞数低，差异有显著性。说明甘氨酸仍有一定的　抑制细胞生长的作用，因此浓度不宜太高。　戊二醛做为高效消毒剂只需很低的浓度　（０．１ｍｇ／Ｌ）就可以表现出细胞毒性　’　Ｊ。人工骨材　料中存在由戊二醛交联作用后的胶原，因此不仅有　原发的而且还有继发的细胞毒性　Ｊ。这意味着人　工骨材料通过充分的清洗，仅能尽量的消除由残留　的戊二醛引起的原发细胞毒性。而通过水解或细胞　酶解生成的游离醛基的继发细胞毒性却会持续的存　在。这就是体外细胞复合培养中，难有细胞黏附的　原因。因此要解决体外培养中细胞黏附的问题，单　纯依靠稀释的方法是不够的，要使用既能中和戊二　醛毒性，中和产物又无明显细胞毒性的拮抗剂。实　验结果证实甘氨酸是理想的拮抗剂。　甘氨酸能够拮抗戊二醛细胞毒性，推测可能是　以下原因：戊二醛通过交联胶原中的氨基酸而使胶　原改性¨川，反应过程中某些中间产物不稳定，分解　后产生醛基对细胞造成损害。而甘氨酸为胶原中最　主要的氨基酸，额外增加的甘氨酸可以使戊二醛与　氨基酸的反应更完全，产生的游离醛基减少，从而达　到降低交联后胶原细胞毒性的作用。　甘氨酸处理后的胶原基人工骨细胞复合体能否　在体内有效成骨，尚需进一步的动物实验证实。　参　考　文　献　１刘怡，房殿吉，李静远，等．小型猪牙周膜细胞体外培养及与三　维支架材料的生物相容性研究．北京口腔医学，２００６，１４（１）：　２０＿２２．　２孙涛，王松灵，朱颉，等．人类涎腺细胞在几种生物材料上的生　长．北京口腔医学，２００３，１１（１）：１－３．　３　Ｗｅａｄｏｃｋ　Ｋ．Ｏｌｓｏｎ　ＲＭ．Ｓｉｌｖｅｒ　ＦＨ．　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ　Ｍｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ａｒｔｆｆ　０瑁ａｎｓ．１９８３－　１９８４，１１（４）：２９３－３１８．　４　Ｓｕｎｇ　ＨＷ，Ｃｈａｎｇ　Ｙ，Ｃｈｉｕ　ＣＴ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ｆｉｘｅｄ　ｗｉｔｌｌ　ａ　ｎａｔｕｒｌａｌｙ　ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ，１９９９，　４７（２）：１１６－１２６．　５　Ｏｒｂａｎ　ＪＭ，Ｗｉｌｓｏｎ　ＬＢ，Ｋｏｆｒｏｔｈ　ＪＡ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｌｌｇａｅｎ　ｇｅｌｓ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ　Ａ，２００４，６８（４）：　７５６＿７６２．　６　ｖａＩｌ　Ｌｕｙｎ　Ｍ．Ｉ，Ｖｉｌｌｉ　ＷａｃｈｅＩｎ　ＰＢ，Ｄａｍｉｎｋ　ＬＯ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ｄｅｒｍａｌ　ｓｈｅｅｐ　ｃｏｌｌａｇｅｎｓ．　Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ，１９９２，２６（８）：１０９１－１１０．　７　Ｏｌｄｅ　Ｄａｍｉｎｋ　ＬＨ，Ｄｉｊｋｓｔｒａ　ＰＪ，Ｖａｎ　ＬｕｙｕＭＪ，ｅｔ　ａｋ　Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｌｉｅｓ　ｏｆ　ｄｅｒｍａｌ　ｓｈｅｅｐ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ，１９９５，２９（２）：１３９－１４７．　８　Ｅｖｂｌ　Ｅ．ＧｒｉｅｓｍａｃｂｅｒＡ，ＧｒｉｍｍＭ，ｅｔ　ａ１．Ｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｌｄｅｈｙｄｅｓ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　ｆｒｏｍ　ｆｉｘｅｄ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ｏｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ａｏｒｔｉｃ　ｅｎｄｏｔｌｌｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ，１９８９，２３（１１）：１３５５－１３６５．　９赵斌秀，李炎，张剑，等．戊二醛中和剂及其中和产物对细胞和　病毒影响的研究．中国消毒学杂志，２００６，２３（５）：３８４－３８６．　１０戴青，孙正，邓小虹，等．戊二醛对牙科手机灭菌效果的实验室　评价．北京口腔医学，２０ｏ４，１２（４）：１８８－１９０．　１　１　ＣｈｅｖａＵａｙ　Ｂ．Ｈｅｒｂａｇｅ　ｎ　ｃｏｌｌｇａｅｎ－ｂａｓｅｄ　ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｓ　３Ｄ　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｔＩｌｅｒａｐｙ．　Ｍｅｄ　Ｂｉｏｌ　Ｅｎｇ　Ｃｏｍｐｍ，２０００，３８（２）：２１１－２１８．　（２００６年１２月２５日收稿）