大肠杆菌O157检测方法概论
及快速检测胶体金方法
□ 韩琰旭 陈发荣 崔德鹏 北京六角体科技发展有限公司
大肠杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌，它大量存在于人及其他恒温动物体内的肠道内，常随人及动物粪便一块排出，会对水源造成污染。若在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。
目前，世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要环境卫生学指标，并对其提出了严格的限制。中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》规定，总大肠菌群及粪大肠菌群每100mL水样中不得检出。
O157型大肠杆菌是20世纪70年代后期发现的新型传染病，能引起人的出血性腹泻和肠炎，且并发溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等，严重的可致人死亡。
中大肠杆菌的方法。多管发酵法是对样品中活菌浓度的一种估计值。
多管发酵法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。比如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数测定。在对一个产气肠杆菌纯培养物作计数时，应采用选择性平板计数法而不要采用多管发酵法。如果待检测的样品是以其他细菌为主的河水，就应选用多管发酵法。2.滤膜法
滤膜法是指用孔径为0.45pm的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，以37℃培养24h，形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中大肠菌群的方法。采用滤膜过滤器过滤水样，将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后
术更快地获得肯定的结果。不过在检验浑浊度高、非大肠杆菌类的细菌密度大的水样时，有其局限性。
目前，国内外研究人员已经应用了一些新方法进行大肠杆菌的快速检测，主要包括酶底物法、聚合酶链反应技术、免疫分析法、电化学方法、荧光法等。3.酶底物法
在GBT5750.12－2006生活饮用水标准检验方法中介绍了大肠菌群和大肠杆菌酶底物法。大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖昔酶(β-D-galactosidase)的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。大肠杆菌酶底物法是指在选择性培养基上能产生p-半乳糖昔酶(β-D-galactosidase)分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生压葡萄糖醛酸酶(β-ghicuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。
酶底物法之所以可以入选国家标准，是由于几乎所有的大肠菌群都有
检测方法简介
检测大肠杆菌的传统方法包括多管发酵法和滤膜法。1.多管发酵法
大肠杆菌多管发酵法是指多管发酵法大肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上以44.5℃培养24h，能产生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水
将滤膜放在品红硫酸钠培养基上进行培养，因大肠菌群可以发酵乳糖，在滤膜上出现紫红色具有金属光泽的菌落。直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，可计算出每升水样中含有的大肠菌群数。如果有必要，对可疑菌落应进行涂片染色镜检，并再接种乳糖发酵管进一步鉴定。
滤膜法具有高度的再现性，可用于检验体积较大的水样，能比多管发酵技
32 食品安全导刊 2013年6月刊Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.分析与检测 ANAlySIS & TEST β-D-半乳糖普酶β-D-galactosidase)活性，94%～97%的大肠杆菌具有β-D-葡糖醛酸糖普酶(β-D-glucuronidase)活性，而且水体和食品中都缺少这两种酶。因此，基于这两种酶的水体和食品中大肠菌群及大肠杆菌的检测方法得到了迅速的发展。4.聚合酶链反应技术
聚合酶链反应技术(PCR，Polymerase Chain Reaction)是利用从耐热菌中分离的DNA聚合酶，加入适量寡聚核普酸引物，以4种脱氧核普酸材料模拟天然DNA复制过程，在实验室条件下特异性扩增DNA(或RNA)片段的一种新技术。
PCR技术经过近20年的发展已经相当标准和成熟，与电化学传感器、酶联免疫分析及表面等离子共振传感器等检测方法结合，已被广泛应用于细菌的检测，成为微生物检测技术中常见而重要的最基础的分析手段之一。
PCR技术检测大肠杆菌有3点局限:一是难以精确定量；二是由于灵敏度高，操作不慎易交叉污染，产生假阳性，三是操作复杂，仪器昂贵，不利于大规模应用。5.免疫分析法
免疫检测技术是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，分为放射免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、酶免疫分析、酶联免疫分析及电化学免疫分析等非均相免疫分析和均相免疫分析。
免疫检测技术具有许多优点:第一，高选择性。抗体的特异性很高，在免疫分析中一般样品不需要预处理，
这一点决定了分析结果的可靠性，同时可以省略预分离的过程。第二，高亲和性。保证分析数据的精密度和分析结果的准确性，这也是达到高灵敏分析的基础。事实上，抗体与抗原复合物的稳定常数一般为109，有些可达1014～1015，有较高的稳定性。第三，高灵敏性。抗体与其复合物间应有较大的信号反差，试剂空白低，从而结果准确而灵敏。免疫检测技术还具有检测时间短、样品通量大、检测成本低等优势。因此，在水体和食品中大肠杆菌的检测领域得到了诸多应用。6.化学发光法
化学发光法是利用物质在进行化学反应过程中伴随的光辐射现象的一种化学分析方法。化学发光法在培养时间足够长的情况下可以检测到非常低的细菌浓度，最低可以准确检测到样品中的几个大肠杆菌。由于对细菌的渗透可以减胞内酶的扩散障碍，加速基底向酶的传递，科学工作者经常利用此来提高检测号。
除了上述的方法外,还有许多快速检测方法,如纳米装置、荧光分析结合免疫技术等方法,以及商业化的快速检测方法包括特异性检验的培养基、检测试纸片等。
以上快速检测方法很少单独使用,更多情况下是多个方法复合使用,以提高检测准确性,缩短检测时间。但是这些方法还有许多方面需要改进,其各自的不足限制了检测方法的推广和运用；而且随着对大肠杆菌的检测速度和精确度要求的不断提高,需要建立更有效的方法,为人们的生活环境及安全提供有力的保障。
快速检测胶体金方法
这是一种简单快捷的肠出血性大肠杆菌检测方法，旨在制备出高灵敏度肠出血性大肠杆菌胶体金试纸条，直接检测样品中的肠出血性大肠杆菌，解决了长期存在的肠出血性大肠杆菌检测周期长，检测操作复杂的难题；此外，本发明采用的免疫胶体金层析分析法，纳米胶体金技术结合免疫原理，检测方法操作简单、方便快捷、准确灵敏,适合现场快速检测，利于检测部门的监控。
需要制备的材料：免疫抗原的制备；免疫小鼠；抗体的纯化；胶体金试纸条的制备。
免疫抗原的制备：将二代肠出血性大肠杆菌菌株制备成菌悬液。
免疫小鼠：选用6～8周的BalB/c小鼠，初次免疫菌悬液与弗氏完全佐剂混合，乳化完全，皮下多点注射，1mＬ/每只，每隔两周，用相同剂量的菌悬液与弗氏不完全佐剂进行加强免疫，共加强免疫两次，最后一次免疫后8～10天小鼠尾部取血，通过间接ELISA测抗体血清效价，则进行小鼠眼部取血。
抗体的纯化：将血清置于Protein G亲和层析柱（KPL）吸附琼脂的表面，用10倍柱体积1×Washing/Binding Buffer洗吸附柱，用4倍柱体积的1×Elution Buffer洗脱，得到肠出血性大肠杆菌特异性抗体。
1.胶体金试纸条制备的具体步骤
（1）胶体金的制备：利用冷凝回流装置将50mL质量分数为0.01%的氯金酸溶液加热至沸腾后迅速加入质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液1.2mL，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却，4℃保存备用，利用投射电镜和紫外光谱扫描
Jun 2013 CHINA FOOD SAFETY 33Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.ANAlySIS & TEST 分析与检测
仪分析胶体金的性状。
（2）标记条件的选择：在酶标板孔中分别加入胶体金100μL，而后依次从少到多加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5μg的肠出血性大肠杆菌特异性抗体，混匀10min后各加入10%NaCl溶液20μL，于10min后肉眼观察反应结果。第一个保持不变颜色的孔的抗PBP2a单克隆抗体加入量即为最少稳定量，最少稳定量增加10%左右为实际标记量，取3支1.5mL离心管各装胶体金1mL，用0.1mol/L HCl和K2CO3分别调pH为7.2、8.2、9.2，加入最佳标记抗体量，对比标记效果。
（3）免疫胶体金制备：取10mL胶体金于三角瓶中，用K2CO3调pH为最佳标记条件，加入最佳标记抗体量，RT搅拌反应30min，得免疫胶体金，8000rpm离心30min，用1mL PBS复溶免疫胶体金备用，将制备好的免疫胶体金喷涂在玻璃纤维膜上制成胶体金垫。
（4）层析NC膜的制备：将羊抗鼠二抗（C线）和肠出血性大肠杆菌多克隆抗体（T线）分别划在NC膜上，制成层析NC膜。
（5）纸条的组装：取一张PVC底板，在离上方18mm处贴上20mm宽的硝酸纤维膜，上方贴上19mm宽的吸水纸，压上硝酸纤维膜1mm，硝酸纤维膜下方贴上结合垫，结合垫压硝酸纤维膜1mm，胶体金垫下面贴上玻璃纤维膜，压上胶体金垫3mm，下端与底板对齐,见图1。
2.大肠杆菌O157快速检测试剂盒
(1）检测原理
本品采用鼠抗大肠杆菌特异性单克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被硝酸纤
测样本中的大肠杆菌O157。
(2）检测范围
肉类、豆制品、海产品，冷饮。(3）技术指标
检测下限：1×103CFU/mL。(4）检测步骤①样品处理:
加4mL无菌生理盐水于5mL装有增菌培养基的离心管中，振摇，使培养基充分溶解，无菌称取剪碎（剪刀灭菌）的样品（固态）0.5g（液态0.5mL），加入增菌培养基中，37℃恒温恒湿4～6h，上清为样品检测液，待检。
②样品检测：
从原包装袋中取出检测卡，水平放置于观察者正面，做好编号标记（打开后请立即使用）。
用包装内所附无菌吸管吸取样品检测液，滴加3滴（约90μL）于加样孔中。加样后开始计时，结果应在5～10分钟内
图2
1.样品垫；2.样液；3.金垫；4.C线（指控线）；5.吸水纸；6.底板；7.层析方向；8.t线（检测线）；
9.NC膜
图1
维素膜作为检测线和质控线，胶体金标记的兔抗大肠杆菌抗体及其他试剂组成。应用层析式双抗体夹心原理定性检
读取，其他时间判断结果仅供参考。
（5）结果判断结果判断见图2。
阴性（-）：T线不显色，表示样品中不含大肠杆菌O157或大肠杆菌O157含量低于1×103CFU/mL;
阳性（﹢）：T线与C线同时出现，表示样品中大肠杆菌O157含量等于或高于1×103CFU/mL;
无效：C线未出现或两条线都不出现，表示前处理操作有误或检测卡已变质失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并重新试验。
（6）注意事项
在环境温度20～30℃下操作；检测卡极易受潮，打开小包装后应立即使用；
本产品在4～30℃密封干燥保存；忌冷冻；检测卡保存期1年；
操作的原则是不能污染待检样品，所有跟待检样品接触的器具都应灭菌，或一次性灭菌器具，操作人员应戴口罩，无菌手套。
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