年月201810ActaMedUnivSciTechnolHuazhonOct. 2018g
动脉粥样硬化靶向C壳聚糖透明质酸纳米D47抗体--聚电解质复合物的合成及理化特性检测∗
余 俊, 聂 秀△, 黄邦杏, 余 兰, 肖桂香, 彭 丽, 董小川
华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科,武汉 430022
,)、,摘要:目的 利用壳聚糖(透明质酸(有效吸附C合成针对动脉粥样硬chitosanCShaluronicacidHA)D47抗体,y
化的靶向纳米给药载体。方法 在水和P以壳聚糖作为聚阳离子,透明质酸作为聚阴离子,二者发生电荷中BS溶液中,)。以扫描电镜、动态光散射及迁移率电泳验证合成的CHA-PECSS-HA-PECS的表观特征及理化特性。将CD47抗体PBS溶液中均具有长期的稳定性;CS-HA-PECS的聚合过程及其物理化学性质受到电荷混合比和聚合物浓度等参数的/影响;形成稳定的C其平均CD47抗体可稳定高效地吸附于CS-HA-PECS的表面,D47CS-HA-PECS纳米颗粒复合物,/粒径在3为动脉粥样硬化靶向75~620nm之间,Zeta电位为正。结论 成功合成了CD47CS-HA-PECS靶向纳米颗粒,纳米给药奠定了基础。
关键词:壳聚糖; 透明质酸; 聚电解质复合物; CD47抗体; 动脉粥样硬化:/中图分类号:TB383 DOI10.3870.issn.1672-0741.2018.05.003j
/,吸附于C其在水和S-HA-PECS表面形成稳定的CD47CS-HA-PECS靶向纳米颗粒。结果 成功合成CS-HA-PECS
,和,合成壳聚糖透明质酸聚电解质复合物纳米颗粒(-chitosan-haluronicacidpolelectroltecomlexnanoarticlesCS-yyypp
/SnthesisandPhsicochemicalProertiesofCD47Chitosan-haluronicAcidPolelectrolteyypyyy
ComlexesTaretinanoarticlesforAtherosclerosispggNp
DeartmentoatholoUnionHosital,ToniMedicalCollee,HuazhonniversitpfPgy,pgjggUyocienceandTechnoloWuhan430022,ChinafSgy,
,)Abstract Obective Inthisstudchitosan(CSandhaluronicacid(HA)wereusedtoeffectivelbsorbtheCD47anti-yyyaj
bodosnthesizethetaretednano-druarrierforatherosclerosis.Methods Withchitosanasthepolcationandhaluronicytyggcyy
,,acidasthepolaniontheeactedwitheachotherinwaterandPBSsolutionandtheircharewasneutralizedandchitosan-h-yyrgy
()aluronicacidpolelectroltecomlexesCS-HAPECsnthesized.Theaarentcharacteristicsandphsicochemicalproertiesyypyppyp
,ofthesnthesizedCS-HAPECnanoarticleswereverifiedbcanninlectronmicrosconamiclihtscatterinndmobili-ypysgepydygga
/tlectrohoresis.CD47antibodasabsorbedonthesurfaceofCS-HAPECnanoarticlestoformstableCD47CS-HAPECyepywp
,taretinanoarticles.Results TheCS-HAPECnano-olelectroltecomlexwassuccessfullnthesizedwhichhadlon-ggnppyypysyg
termstabilitinwaterandPBSsolution.ThepolmerizationprocessandphsiochemicalproertiesofCS-HAPECnanoarti-yyyppcleswereaffectedbarameterssuchascharemixinatioandpolmerconcentration.CD47antibodouldbestablndeffi-ypggryycya
/cientlbsorbedonthesurfaceofCS-HAPECnanoarticlestoformastableCD47CS-HAPECnanoarticlecomositewithanyappp/averaeparticlesizeof375-620nmandapositivezetapotential.Conclusion CD47CS-HAPECtaretinanoarticlesweregggnp
,successfullnthesizedinthisstudwhichlasasolidfoundationforatherosclerosis-taretinano-drueliver.ysyyyggngdy
;;;Keords chitosan haluronicacid polelectroltecomlexes antibodD47; atherosclerosisyyypyCyw
△
,,YuJunNieXiuHuananxinetalgBgg
来自美国斯坦福大学医 在一项最新的研究中,
学院的研究人员发现让肿瘤细胞表面保护肿瘤本身免受免疫系统吞噬的一种信号也在动脉粥样硬化形
1]
。研究发现,成过程中发挥着作用[相对于正常的
存在,而且与不良临床事件(如中风等)的发生密切相关。细胞实验中,在模拟动脉粥样硬化的环境下,抗CD47抗体可诱导凋亡的平滑肌细胞和巨噬细胞清除,从而减少早期动脉粥样斑块的形成。在几种不同的动脉粥样硬化模型小鼠中,利用抗CD47抗体阻断C可显著地减少动脉粥样斑D47信号通路,块堆积,使动脉粥样斑块不容易发生碎裂,且使得多数小鼠体内的粥样斑块缩小,这是在动脉粥样硬化治疗模型的小鼠体内很少观察到的现象。如果在人
血管组织,CD47抗原在动脉粥样硬化组织中大量
);国家自然科学基金青年基金资助项目(华中科技大No.81200104
)学同济医学院附属协和医院创新基金资助项目(No.2017-314
:余 俊,女,主治医师,医学博士,1982年生,E-mail89679676@q.q
∗
com
△通讯作者,,:CorresondinuthorE-mailniexiuishi@126.compgay
余 俊等.动脉粥样硬化靶向C壳聚糖透明质酸纳米聚电解质复合物的合成及理化特性检测D47抗体--
·527·
体研究中抗CD47抗体也能实现对动脉粥样斑块的这种抑制效果,抗CD47抗体则有望被用来治疗号称世界头号杀手的心血管疾病,而且是针对这种疾——动脉粥样硬化斑块———而不是高病的直接病因—
胆固醇或高血压等风险因子来实现。如何利用CD47抗体实现药物的有效传递是未来研究中需要
解决的关键问题。
在过去几年中,通过带相反电荷聚离子的静电,,尤其是作为药物载体传递系ltecomlexPEC)yp]
[,可作troltecomlexnanoarticlesCS-HA-PECS)ypp
]21-22
。研究表明C为载体进行药物传递[S-HA-其转染PECS是一种非常高效无毒的非病毒载体,
细胞平均存活率在90%以上。用离子凝胶法制备的透明质酸与卵清蛋白(金属纳米颗粒可作OVA)
[4]
。约为2载体效率高达650~350nm,0%2
合物纳米颗粒(chitosan-haluronicacidpolelec-yy
23]
。为疫苗佐剂,增强鼻腔和皮内疫苗注射的活性[
合成透明质酸壳聚糖聚电解质纳米粒子的平均大小
基于以上研究,本研究旨在结合壳聚糖(和CS)
相互作用来制备纳米聚电解质复合物(olelectro-py
统2-3制备相对简单,受到研,究其合成对工艺要求及设备要求不高者的广泛关注。PEC纳米颗粒的,
在不使用有毒有机溶剂和化学交联剂的情况下,可以在温和的条件下进行,便于推广。因此,可将D47抗体作为主动靶向分子吸附在纳米表面,利用纳米颗粒包被的药物运输至病变细胞表面CD47抗体与抗原的特异性结合将PEC颗粒,而对不PEC表达CD47抗原的正常细胞基本不产生影响。通过抗体阻断动脉粥样硬化组织表面达到治疗动脉粥样硬化斑块的CD47的表达及药物的靶向传递作用,目的。
影响聚电解质复合物纳米粒子形成的理化因素很多,如pH值、温度、电离度、离子强度和相互作用时间,其稳定性还取决于形成聚电解质复合物的不
同成分的摩尔质量和电荷混合比[
4
]是开发一种利用壳聚糖和透明质酸相互作用。本研究的目的,吸附D47抗体后形成的输送系统。壳聚糖(CD47靶向乙酰基得到的多糖。ch壳聚糖具有生物相itosan,CSP)
E是C纳米颗粒药物
甲壳容素性部[5分]
物降解性,无毒性[6],脱有伯胺基(的环境可以质子化-NH2),其中的氨基葡萄糖残基在弱酸性,易于合成及获得[
7]
。壳聚糖含生。这一特性使得壳聚糖可与各种
阴离子,如硫酸葡聚糖[8]、硫酸软骨素[9
]羧甲基纤维素[10-12]等形成聚电解质复、角合叉物菜。胶透、明聚质半乳酸糖、海藻酸钠(h醛y
al酸[
13-14-]
cid,H是一种低电荷密度的多元弱酸,是高等动uronic物细胞外基质的组成成分之一A)
。透明质酸具有高润
滑力及吸水性的特点,并可以参与体内细胞的迁移、
粘附和增殖等生理功能[
15
]关节炎治疗、伤口愈合、组织工程以及生物材料的植
。透明质酸在眼科手术、入等方面已经有很成熟的应用[
16-18
]明,和壳聚糖一样,透明质酸也可以与聚赖氨酸。同时有研究表[
19-20]
和丝素蛋白等形成聚电解质复合物,应用于生物纳米材料合成。
最近有研究报道壳聚糖/透明质酸聚电解质复
透明质酸(聚电解质复合HA)物的优点纳米颗,研发用于粒,为后期CD利47抗体吸附的用抗体阻断CD47抗原作用及靶向药物递送,为CD动47抗脉粥样硬化的防治打下前期基础。因此,我们检测了几种非化学计量条件下CS-HA-PECS的表征,研究其在生理条件下的稳定性;并对透明质酸和壳聚糖的摩尔质量和络合条件(摩尔混合比,聚合物浓度)进行监测,检测形成的,C还研究了S-HA-PE分D47抗体具有稳定的吸附性CC。SS的粒径大小、散性及稳定性;此外-HA-PECS是否对C1 材料与方法
1.1 实验材料
乙酰化率(洋生物工程有限公司提供DA)
不同的壳聚糖由济南海得贝,海摩尔质量(:在乙Mw酸)水在溶10液0~中60溶0kDA解,/分别为通m5%和48%,过ol之间。样品纯化如下g,用氨沉淀,用去离子水漂洗至中性并冷冻干燥Milliore膜过滤p
。纯化的壳聚糖用乙酸酐乙酰化。壳聚糖在m0.2
(Wol/L乙酸/0.1mol/L乙酸钠缓冲液中以0.亚硝酸钠溶/V)浓度溶解液。。反向壳聚糖溶液中加入应在适度的磁力搅拌0.下15mo5l/%L~直到中性60min。进行,最后冷冻干燥用氨沉淀回收壳聚糖。不同摩尔分子量的透明,用去离子水洗1涤5质酸由镇江东元生物科技有限公司提供,摩尔质量从公司提供。根据tSian1t5,aC00rukzg/mol至50kg
/mPoile。rce抗,提供的程序(TChDe4r7抗体由ficHudsonNH,moScien-
。
USA),通过BCA测
定并确认抗体浓度1.2 聚电解质溶液的制备
将溶解,以0.0.11%质量浓度的壳聚糖在水或mol/L氢氧化钠或盐酸将P溶BS溶液中
液的值调节至pHμ
m孔径的4.M0il。li使ore用膜之上前过,将滤壳。聚在糖水溶或液在0.22
中,在磁力搅拌器p内制备浓度为0.1%的P透BS溶液明质酸
CCa·528·溶液。
1.3 聚电解质复合物的形成
华中科技大学学报(医学版) 2018年10月第47卷第5期
,合摩尔电荷比)加入壳聚糖和透明质酸聚电解质溶/液。在室温下,以磁力搅拌器搅拌,在750rmin条件下,形成壳聚糖透明质酸聚电解质复合物,并使得0.1%。将形成的聚电解质复合物溶液在20℃下,
/,以7使得沉淀从溶液中析000rmin离心10min出。除去上清液,将析出的沉淀重新悬浮于去离子复合物的最终颗粒分散体积为3固体含量为0mL,
+-/n在非化学计量条件下(R=n≥1,R为混
中原始对照样品溶液中滴定的CD47抗体含量;
CD47抗体残留量是指去除的上清液中滴定的CD47抗体含量。2 结果与讨论
2.1 聚电解质复合物的形成
量×100%。其中CD47抗体投入量是指每次实验
明质酸电离后的羧基(相互作用,两者在合COO-)适的摩尔电荷比的条件下,形成壳聚糖透明质酸聚壳聚糖离子化后形成的氨基聚糖(与透NH3+)
水或 P聚电解质复合物固体含量测定
BS中。
.4壳聚糖透明质酸聚电解质复合物在燥24h后,称量析出颗粒的重量,其与溶6液0的℃下干
初始重量之比即为固体含量。
.5 聚电解质复合物物理化学表征的检测
利用析测试中心Ma)l,v使用ern1N0mWanosizeHrSe/ZN(e华激光束中科技,
大在参数学分质复合物分散体的动态光散射测量=633nm(散射角为173°
)的条件。下所有数据至少,进行聚电解在25℃测量法得出,其定义为3次。多分散性值第二累积量,(次实验共6次Γ测)
量是μ2的平/(平均Γ)均衰2:值减其中PI由软件提供的算。率Z。μ2是相关函数的
eta每电个位测用量S值mo取lu3howski方程的电泳迁移率来测定。用-
anosizerSZ在Malvern
颗粒悬浮在氯化钠溶25℃测定颗粒的电泳迁移率(将洗涤的PEC液中进行μ电E)泳。迁移描电子显。率实验,取a微chi镜S-(41相对误80次测量的平均值,差为%Hit00显微镜在5kV下获得PEC纳米颗粒分散液滴沉积在样品架上SEM)图像。将0.01,在室温下风干
%(V/扫
V)PEC(2h电子显微镜Tec,
hn并ic在Hu氩m气mer保Ⅱ护,气H氛下涂,覆钯阴极蒸。发扫器描术中心进行S。
EM检测在华中科技大学分析测试技oustonTX,USA).6 CD47抗体对壳聚糖透明质酸聚电解质复合物纳米颗
粒的吸附实验
将壳聚糖透明质酸聚电解质复合物溶液(
壳聚糖Mw200kg
/mol,DA=48%;透明质酸Mw=50度搅拌g
/mol,)清液。使和不同浓度抗体溶液得混合物最终的混(C合D4混合,适摩7抗体)尔电荷比.5;混合物在将沉淀重新悬浮在相同体积缓冲液中14000×g下离心10min后,除去上R=
。抗体吸附率计算如下:抗体投入量-CD47抗C体D残47抗体吸附率留量)/CD47抗=体(CCD投D447入
7
电复合物(CS-HAPEC)
(图1)。图1 壳聚糖(意图
CS)和透明质酸(HA)
之间聚电解质络合反应的示Fig
.1Schematicdiagramofthepolyelectrolytecomplexationre-actionbetweenchitosan(CS)andhy
aluronicacid(HA)摩尔质量mol,DA48%的10壳0k聚g/糖m,o与l,平DA5均摩%尔,以质及量2在00k15g
/k合反应g/mol至,进5行0k聚g
/电m络ol之间的透明质酸进行聚电0络0
合的两者成分R控制为研究中获得了各种不同粒径1.5。们的平均尺寸和络合后的粒径分布CS-HA-,P发现透明质酸ECS,测量它摩尔质量的增加会导致21500kP/EmC颗粒尺寸显著增加(
)。图摩尔质量为ol的透明质酸样品,与壳聚糖溶液混合后,在实g验中没有形成这表明如此高摩尔分子量的透明质PEC颗粒,只能形成沉淀。酸使得聚电复合物在形成的过程中,不能将其亲水基团在溶液介质中充分展开,从而不能形成有效的悬浮颗粒,最终只能以聚集沉淀的形式析出。因此后续实验中没有对这一量级摩尔质量的透明质酸进行研究。图2所示的变化趋势表明,随着透明质酸摩尔质量增加,形成中之增加PEC的动态光散射检测出的多分散指数PEC的颗粒直径增加,在溶液。因此,通过反复试验对比,得出了形成PI也随HA-PECS所需的最佳的透明质酸CS-
k的粒径最小g
/mol,摩尔质量为在这、多分散性指数最低个参数条件下形成。
的CS-HA-PEC50S11λcN511k1余 俊等.动脉粥样硬化靶向C壳聚糖透明质酸纳米聚电解质复合物的合成及理化特性检测D47抗体--
·529·
/,,/,将透明质酸分别与摩尔质量为1以及摩尔质量为2的壳聚糖在水中进行聚00kmolDA为5%(▲)00kmolDA为48%(■)gg电解质络合反应,保证两者之间的正负电荷比R为1.5。
)图2 不同摩尔分子量的透明质酸对所形成的聚电解质复合物的大小及分散指数(的影响PI
()Fi.2EffectofhaluronicacidofdifferentmolarmolecularweihtsonthesizeanddisersionindexPIofolelectroltecomlexesygppyypg
无论在哪种乙酰化率的情况下,增 如图3所示,
加壳聚糖的摩尔质量都会增加聚电解质复合物的平均粒径,多分散指数PI也会增加。这些结果提示随着壳聚糖摩尔质量的增加,壳聚糖/透明质酸聚电解质复合物纳米颗粒的大小及P但是I值也随之增加,这一增加趋势并不是均匀一致的,而是存在一个临界摩尔质量。当壳聚糖摩尔质量低于临界质量时,
无论壳聚糖的摩尔质量如何增加,都可以在溶液中形成颗粒结构致密均匀的C但是当壳S-HA-PECS;聚糖的摩尔质量超过临界值时,所形成的CS-HA-/。质量均为200kmolg
PECS的直径会急剧增加。图3的实验数据表明在
乙酰化率分别为5%和4壳聚糖的临界摩尔8%时,
,///和4摩尔质量从2在正负电DA分别为5%(▲)8%(■)0×kmol至500kmol的壳聚糖与摩尔质量为50kmol的透明质酸,ggg荷比为1在水中进行反应。.5条件下,
)图3 壳聚糖摩尔分子量(影响聚电解质复合物的颗粒大小和分散指数(Mw)PI
(()Fi.3EffectofthemolarmolecularweihtMw)ofchitosanontheparticlesizeanddisersionindexPIofPECSgpg
我们得出如下结论,为了获得粒 由图2及图3,
径小且分散均匀的聚电解质纳米颗粒,需要低中摩/)/尔质量的壳聚糖(约2和500kmol0kmol的gg透明质酸混合作用,而壳聚糖乙酰化率对聚电解质复合物纳米颗粒的形成则影响不大。
2.2 电荷变化对聚电解质复合物物理化学特性的影响
全不能溶解,则得到完全的水溶性聚电解质复合物或沉淀。为了获得不随静置时间延长而发生聚集的本研究着重研究电荷变化对所PEC纳米胶体溶液,
形成的聚电解质复合物稳定性的影响。乙酰化率
如前所述,由于壳聚糖及透明质酸混合溶液中阴离子与阳离子的相互络合作用,在溶液中可自发形成不同大小聚电解质复合物纳米颗粒。在两种极端的情况下,如果所形成的PEC颗粒完全溶解或完
(/为4摩尔质量为2DA)8%,00kmol壳聚糖与低g
/)摩尔质量(的透明质酸在水或P50kmolBS中,g以正负电荷比(分别为0R).5、1.5、2.5和3.5进行表1列出了这些纳米粒子的粒径、PI多分散性指数、Zeta电位和外观。
聚电解质络合反应,形成聚电解质复合物纳米颗粒。
·530·
华中科技大学学报(医学版) 2018年10月第47卷第5期
表1 不同电荷比下合成的PEC物理化学特性
大小(nm)10503202601180590392330230
PI
Table1 PhsicochemicalcharacteristicsofPECssnthesizedunderdifferentchareratiosyyg
溶液水
正负电荷比
0.51.52.5
PBS
3.50.51.52.53.5
固体含量(%)
-521-431
Zeta点位(mV)25.00±1.6331.00±0.2343.00±0.1732.00±0.1342.00±0.2745.00±0.31
--外观沉淀中等浊度中等浊度低浊度沉淀中等浊度中等浊度低浊度
1.00.10.10.11.00.10.10.1
/m),/)透明质酸( 壳聚糖(DA48%,Mw200kolMw50kmolgg
肉眼可观察到凝絮样物析出,静置 当R=0.5,24h后可重新溶解。凝絮样物重新再溶解的原因可能是因为壳聚糖和透明质酸初始形成氨基和羧基聚电复合物后,稳定下来的基团在溶液中自主重排,使得聚电解质复合物的疏水基团及亲水基团的二级结构发生改变,从而重新在溶液中溶解。当电荷比接近1,由于电荷完全中和,形成的聚电解质复合物纳米颗粒的粒径显著增加。由于中性的非带电环境,没有静电电荷来抵消范德瓦尔力对于所形成的从而导致PPEC的作用,EC发生沉淀。当电荷比从1继续增加时,所形成的PEC的粒径开始减少,因而增强了PPEC对于范德瓦尔力的抵抗作用,EC在溶液中的稳定性。当R为1聚电解.5到3.5时,质复合物纳米颗粒在水中直径分布在230~320nm之间,在PBS中直径分布在330~590nm之间。所形随着PEC中壳聚糖数量的增加,R随之增加,Zeta电位也随之增加。扫描电镜检测了壳聚糖透明质酸聚-时测定,PEC颗粒显示出明显的粗糙表面。
成的CS-HA聚电解质复合物的Zeta电位均为正。电解质纳米颗粒的球形形貌,如图4所示,在R=1.5这是因为P从而增强了EC上所带净电荷量的增加,
2.3 关于聚电解质复合物稳定性研究
水和pH=7.4的PBS溶液中制成不同浓度的混合PEC微粒的平均粒径。在水溶液中的PEC纳米颗
粒可保存稳定1个月。当R=1在实验的第.5时,物,静置1个月后用于实验。用弹性光散射测量了
为了研究P将PEC的稳定性,EC颗粒分别在
)。分散指数P表2,表330天,I值明显增加(
图4 扫描电子显微镜示壳聚糖透明质酸聚电解质复合物超微
结构
Fi.4Scanninlectronmicroscohowintheultrastructureofgepysgg
CS-HA-PECS
Table2 EffectofchareratioonthestabilitfCS-HA-PECSinthewatergyo
)时间(d014307
R=1.5
R=2.5
R=3.5
表2 时间、电荷比对水溶液中CS-HA-PECS胶体稳定性的影响
大小(nm)320300250152
0.10.10.20.3
PI
大小(nm)280242223201
0.10.10.10.2
PI
大小(nm)260253203121
0.10.10.10.2
PI
;/摩尔质量2透明质酸摩尔质量5 壳聚糖:DA48%,00kmol0kmolg/g
余 俊等.动脉粥样硬化靶向C壳聚糖透明质酸纳米聚电解质复合物的合成及理化特性检测D47抗体--表3 时间、电荷比对PBS溶液中CS-HA-PECS胶体稳定性的影响
R=2.5
·531·
Table3 EffectoftimeandchareratioonthestabilitfCS-HA-PECSinPBSsolutiongyo
)时间(d014307
R=1.5
R=3.5
大小(nm)603591553306
0.10.10.10.3
PI
大小(nm)404381372225
0.20.20.20.2
PI
大小(nm)398365320216
0.10.10.10.2
PI
/;/摩尔质量2透明质酸摩尔质量5 壳聚糖:DA48%,00kmol0kmolgg
PEC的胶体颗粒在水中的粒径比在,反映了PBS中的
粒径要小稳定模式。由于疏水作用PEC复合物是通过静电作用达到,聚电解质复合物中壳聚糖内部的亲水基团会延伸至溶液中亲水的外围区,从而防止存在着盐离子的静电作用PEC在溶液中的聚集。由于,所以PEC聚合物的稳定PBS溶液中性受到盐离子的干扰,不像在水溶液中那么稳定和紧密,所形成的表3所示,关于PPEECC颗粒具有更大的平均直径。如直径的变化,
我们可以观察到个显著的特点:第一,随着电荷比R的增加,粒子的2直径变小;第二,无论溶液的类型以及电荷的比值是多少,粒子的直径都会随着时间的增加而减小。这可能是由于此过程中粒子结构的重组导致的。而同时溶液的粒径分布指数PI增加,表明粒子的分散范围扩大。
.4 CD47抗体吸附实验
在水和于BS两种不同的溶液中,CD47抗体对
BSCS和-H水A-中PP对ECCS的吸附动力学是相似的。D47抗体的最大负载容量P分E别C在
为
度范围内.5g/L和,C0.D467g/抗体对于L(表4)。在本研究的蛋白质浓,即D47抗体的量会随着初CSP始-EHAC的吸附没有达到纳米颗粒负载的饱和度蛋白-P质EC浓S表面吸附的
度升高而增加。因此,上述结果表明合成的负载CS能-H力A。-P当ECS对
抗体吸附到D47抗体具有高亲和力和高结合PCD47的EC纳米颗粒表面上后,
我们通过离心除去未抗体溶液上清,并将得到的D47抗体复合物再次溶解后,离心沉淀,并收集离PEC-心的上清。在第2次离心后的溶液上清中,仅能检测到大约果提示C1D4%的游离状态的7抗体可高效稳CD定47抗体。该实验结
地吸附在ECS表面。CS-HA-对于固体含量为0.1%的温和搅拌的条件下,CD47抗体吸附于CS-HA-PPEECCS纳米颗
,
当在粒表面后,会使得纳米颗粒大小增加到415~650
位在水中从m,吸附CD+47抗体后20mV上升到CS-HA纳米颗粒的+25mV,在PBZSeta电
溶液中从位升高表明抗体通过离子相互作用形成互穿网络+12mV上升到+18mV,粒径增大和Zeta电
,部分整合到纳米粒子结构中。EC纳米颗粒可在室温下稳定保持CD47吸附的3周。
CS-HA
表4 水或不同初始浓度PBS中p
CCSD-4HA7抗体的吸附率-PEC纳米胶体溶液对
(Table4 Absortionrateofdifferentinitialconcen%tra)
tionsofCD47antibodybyCS-HA-PECnanocolloidsolutioninwaterorPBS(%)时间(h)PBS中CD47的输入(/L)水中CD47的输入(/L)0.10.30g.50.20.4g0.62959190939185497
98959593906
10099
97
99
99
95
1610010010010010010024100
100100100100100 当电荷比为00kg/mol,DA1.为5时,48%C,S透明质酸摩尔质量为-HA-PECS颗粒中壳聚糖摩尔质量为
50kg/m
ol 结论
本研究以透明质酸和壳聚糖合成了带正电荷的
聚电解质复合物纳米颗粒(下,性3C0dS-H。A进一步研究表明-PECS可在生理介质中保持其胶体稳定CS-HA-PECS)。在室温地吸附在CS-HA-PECS表C面D4。7抗体可以稳定高效
查阅相关文献及结合预实验结果,最终用于合成为:低中摩尔质量壳聚CS-HA量约在1.550k至g
3/糖(约.5mo范l的透明质酸,2电荷比00kg
/-PEC围内。在去离子水或Rm(onl+)S/,的参数n摩-)尔保持质的CS-HA-PECSC的直径S-HA-PBS溶液随PE着CS透。明实验中发现质酸和壳聚,合成中均可获得稳定的糖正负电荷比R的增加而减小,但是壳聚糖的乙酰化率
2nPP023CCCP·532·
华中科技大学学报(医学版) 2018年10月第47卷第5期
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(对CDA)S-HA-PECS形成过程的影响不大。
抗CD47抗体与CS-HA-PECS的缔合具有快速的动力学特性,并且在水及PBS溶液中都具有较高负载能力。C在S-HA-PECS吸附CD47抗体后,水和PBS中粒径分别为375nm和620nm,Zeta电位为正值,并且在3周内保持稳定。上述结果表明壳聚糖透明质酸聚电解质纳米颗粒对于CD47抗体具有较高的负载能力,并且在生理缓冲液(中PBS)可保持较好的胶体稳定性。因为壳聚糖和透明质酸均是来自生物质的无毒多糖,因此为下一步研究利用CD47抗体靶向抗动脉粥样硬化的生物纳米药物递送系统打下了基础。
参 考 文 献
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