淀粉酶发酵条件的优化2

YUNNAN NORMAL U NIVERSITY

本科学生综合性实验报告

学号 084120402 姓名 茶金梅 学院

生命科学

专业、班级 08生技

实验课程名称 ____ 酶工程实验 ________________ 教师及职称 ______________李俊俊 _____________ 开课学期 2010 至2011学年

上

学期

填报时间 一2011 __ 年 ____ 12 月一29— 日

云南师范大学教务处编印

•实验设计方案

实验名称

淀粉酶产生菌的发酵条件优化

实验序号 生物基础2 实验室 实验时间 2010年12月 1. 实验目的 了解酶制剂生产过程中实验室发酵条件优化的基本方法。 2. 实验原理、实验流程或装置示意图

2.1实验原理

⑴用微生物生产酶制剂受以下制约：培养基成分、物理条件。 ⑵ 为了得到最佳产酶量，必须对这些因素进行优化，并通过单因子分析、正交 试验

找出最适合的发酵工艺条件。 ① 碳、氮源是组成微生物细胞蛋白质、酶和核酸的主要元素之一，是影响酶产 量的

两个重要因素。

② -淀粉酶产生菌的发酵是好氧过程，因而发酵液中的溶氧浓度是发酵过程中 的一

个需要调节的重要参数。

a

③ 接种量大小是决定菌体在发酵培养基中生长速度的一个重要因素，选择适当 的接种量是必要的。

④ pH是决定菌体在发酵培养基中生长速度的一个重要因素，因此最适 pH的选

择就显得格外重要。 ⑤ 发酵时间的长短决定了反应是否能完全发生，因此发酵时间也是发酵过程中 的一

个需要调节的重要参数。 ⑶ 正交试验：用正交表来安排实验分析和实验结果。

① 正交试验设计一般来说包括两部分 ：试验设计，也即方案的选择与确定；

数据处理，进行统计推断。 ② 正交试验设计的基本步骤：

第一步，确定目标、选定因素（包括交互作用）、确定水平； 第二步，选用合适的正

交表； 第三步，按选定的正交表设计表头，确定试验方案； 第四步，组织实施试验；

第五步，试验结果分析。 ③ 正交试验的结果分析：极差分析、方差分析。

方差分析：将总的离差平方和分解成各因素及各交互作用的离差平方和，构 造F

统计量，对各因素是否对试验指标具有显著影响，作 F检验。 ④ 确定最优方案

如果不考虑交互作用，则根据各因素在各水平下的总产量或平均产量的高低 确定 最优方案；如果考虑交互作用，则取各种搭配下产量的平均数，按优化标准 确定最优

方案。

2.2实验流程 配制种子培养基

配制发酵培养基 3 •实验设备及材料

摇瓶发酵 测酶活

确定最佳方案

验结果

3.1设备

250mL三角瓶、移液管、大试管、培养皿、电子天平、超净工作台、培养箱、 恒温调速摇瓶柜、离心机(离心管)、恒温水浴锅、分光光度计、比色皿、记时 器、电冰箱、 3.2试剂 蛋白胨、酵母膏、NaCI、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、MgCl2 6H2O、CaCb 2H2O 4.实验方法步骤及注意事项 4.1试验方法步骤 4.1.1种子培 的配制 蛋白胨 1.0% [ 酵母膏 1.0g% L pH5.5 NaCI 0.5% 一 将菌种接种到装有种子培养基的 250mL三角瓶内，于37C, 200rpm,培养16h。 4.1.2单因子分析 4.1.2.1碳源浓度对发酵产酶的影响 在六只 250ml 三角瓶中，依次加入 0.35g( 0.5%)、0.70 g( 1.0%)、1.05 (1.5%)、 1.40 g (2.0%)、1.75 g (2.5%)、2.10 g (3.0%、葡萄糖，然后在六只三角瓶中都 力卩入 0.7 g NH4NO3、 0.07g KH2PO4、 0.035 g MgCl2 6H2O、 0.007 g CaCl2 2H2O 和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0,高压灭菌，冷却后各接入11.2ml (16%) 的种子培养基，相同培养条件下(37C, 72h，200rpm)摇瓶发酵，测定酶活。 4.1.2.2氮源浓度对发酵产酶的影响 在六只 250ml 三角瓶中，依次加入 0.35g( 0.5%)、0.70 g( 1.0%) >1.05 (1.5%)、 1.40 g (2.0%)、1.75 g (2.5%)、2.10 g (3.0%) NH4NO3，然后在六只三角瓶中 均加入 1.4g 葡萄糖、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2 6H2O、 0.007 g CaCl2 2H2O 和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0,高压灭菌，冷却后各接入11.2ml (16%) 的种子培养基，相同培养条件下(37C, 72h, 200rpm)摇瓶发酵，测定酶活。 4.1.2.3培养基pH对产酶的影响 在七只三角瓶中各加入 1.4g葡萄糖、0.7g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2 6H2O、0.007 g CaC2 2H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，pH依次调至3.5、 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5,高压灭菌，冷却后各接入 11.2ml (16%)的种子 培养基，相同培养条件下(37C, 72h, 200rpm)摇瓶发酵，测定酶活。 4.1.2.4发酵时间对产酶的影响 在六只三角瓶中各加入 1.4g葡萄糖、0.7g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2 6H2O、0.007 g CaC2 2H2O 和 70ml 蒸馏水，搅拌溶解，调 pH 至 6.0,高 压灭菌，冷却后各接入11.2ml (16%)的种子培养基，摇瓶发酵(37C, 200rpm) 48h、60h、72h、84h、96h、108h,测定酶活。 4.1.3酶活的测定 4.1.3.1稀释酶液 4.1.3.2 操作步骤 步骤1 步骤2 步骤3 空白管 吸取1.8mL淀粉底物 溶液 I 50E保温5分钟 样品管A 吸取1.8mL淀粉底物 溶液 50 r保温5分钟 样品管B 吸取1.8mL淀粉底物 溶液 50 r保温5分钟 加入待测酶液0.2毫 升 加入待测酶液0.2毫 升 步骤4 步骤5 步骤6 步骤7 步骤8 步骤9 步骤10 50C精确保温10mi n 50 E精确保温10mi n 50 T精确保温10mi n 加入3mLDN黴剂终 加入3mLDNSC剂终 加入3mLDNS试剂终 止反应 止反应 止反应 混合均匀 混合均匀 混合均匀 加入0.2毫升待测酶 液，沸水浴煮沸5min 流水冷却 加蒸馏水10mL混匀 0®onm比色 沸水浴煮沸5min 流水冷却 加蒸馏水10mL混匀 OD40 nm比色 沸水浴煮沸5min 流水冷却 加蒸馏水10mL混匀 OD40 nm比色 4.1.4正交试验 4.141根据碳源浓度、氮源浓度、pH、接种量对酶活性的影响，每个因素选取

三个水平（水平即在因素的允许变化范围内， 要进行试验的“点”）进行正交 试验。

A碳源浓度 1 2

B氮源浓度 最优一0.5% 最优 最优+0.5% C接种量 最优一 2% 最优 最优+2% D pH 最优一 0.5 最优 最优+0.5 最优一0.5% 最优 最优+0.5% 3 4.1.4.2按照正交表 --- L9表（L是正交表的代号，L右下角的数字表示试验次 数）进行试验。

试验号 1 2 3 4 5 A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 B 1 2 3 1 2 3 C 1 2 3 2 3 D 1 2 3 3 1 2 2 3 1 6 1 7 1 3 8 2 1 9 3 2 4.1.4.3进行方差分析 4.1.4.4得出最佳方案 4.2注意事项

⑴ 灭菌锅使用时，先检查是否有水，再接通电源。

⑵ 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落。 ⑶ 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或 DNS时，枪头不要触碰管壁，也不 要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头， 实验结束后要及时清 洗枪头。 ⑷ 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理。 ⑸煮沸和用流水冲洗时要避免试管进水。 ⑹ 接种时要保证在无菌环境下操作。

⑺ 分光光度计使用时应提前半小时接通电源， 打开机器开关使仪器通电，自检。 ⑻ 测酶活时，将对照液及测定液分别装入比色杯 3/4体积并用镜头纸擦干外壁， 放入

样品室。

⑼读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于 中。

⑽ 水浴锅中的水量要超过试管中的液面。

(11) 接种后应振荡接种瓶，使菌种充分与培养基混合。

30%酒精

(12) 正交试验设计时，确定因素应根据试验目的，选取主要因素，略去次要因素； 确定

因素的水平时，应尽可能的保持各因素的水平数相同， 以方便试验数据的处 理。 5 •实验数据处理方法 5.1酶活的计算

酶活=[(0.9511x+0.0493) X 1000X n] /( t X VX M)

(其中，0.9511X+0.0493 :葡萄糖的标准曲线方程；x: OD值；n：稀释倍数；t : 反应时间；V:酶液的体积；M葡萄糖的分子量)

0.1%葡萄糖的标准曲线

y = 0.9511X + 0.0493

R = 0.9919

5.2正交试验结果的分析 利用SPSS寸正交试验结果进行方差分析，得出实验的最佳方

案。 6.参考文献

[1] 余龙江.发酵工程原理与技术应用.北京：化学工业出版社， 2006 [2] 陈守文.酶工程.北京：科学出版社，2008

[3] 安戈等.1株酸性a -淀粉酶产生军的鉴定及发酵条件优化 .安徽农业科学，2009 [4] 刘建军,姜鲁燕.根霉PE-8菌株的选育及其淀粉降解酶类的研究 1998(02) ⑸ 孙君社.酶与酶工程及其应用•北京：化学工业出版社.2006

⑹ 李春喜等•生物统计学(第四版)•北京：科学版社.2008 二.实验报告

1.实验现象与结果 1.1实验现象 ⑴ 发酵培养基经灭菌后颜色会发生变化，由原来的白色变为亮黄色。 ⑵ 摇瓶培养后，三角瓶中溶液的上方会出现一圈沉淀物。 ⑶ 沸水煮沸5min后，溶液的颜色加深，并且空白管中溶液的颜色比其余两管的

要浅一些。

⑷ 做正交试验时，摇瓶培养后三角瓶中出现了一些球状物 1.2实验结果

1.2.1碳源（葡萄糖）浓度对发酵产酶的影响 碳源浓度（% A管的OD值 B管的OD值 0.5 1.152 1.234 1.0 1.515 1.496 1.5055 41.144 1.5 1.725 1.656 1.6905 46.032 2.0 1.987 2.001 1.994 54.050 2.0 0.032 0.051 0.042 4.958「 2.5 3.764 3.988 3.876 103.771 2.5 0.055 0.057 0.056 5.698「 3.0 2.931 2.656 2.7935 73.803 3.0 0.004 0.005 0.0045 2.977 平均值 : 1.193 : 32.888 酶活 1.2.2氮源（NH4NO3）浓度对发酵产酶的影响 0.5 1.5 N源浓度（%） 1 0.042 -0.057 -0.094 A管的OD值 0.043 -0.023 -0.020 B管的OD值 平均值 0.043 : -0.040 : 酶活 5.010「 0 123培养基 pH对产酶的影响 -0.057 : 0 PH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 A管的0叫「 0.019 -0.011 0.023 1.247 1.752 「1.379 「1.083 0.013 -0.011 0.021 1.441 1.291 B管的OD值 1.680 1.391 1.344 1.716 1.385 1.187 平均值 0.016 -0.011 0.022 1.792 1.951 36.877 46.705 「37.960 「32.729 酶活 0 1.2.4发酵时间对产酶的影响 发酵时间（h） 48 60 72 84 96 108 A管的ODfi 0.113 P 1.500 1.523 0.149 : 0.191 0.135 B管的ODfi 0.115 1.621 1.630 0.158 0.194 0.178 0.114 1.446 1.577 0.154 0.195 0.157 平均值 5.438 : 酶活 4.381 :39.572 43.033 6.521 5.517 1.2.5正交试验

125.1各个因素选取的三个水平 水平 A碳源浓度 （% 1 2.0 2 2.5 3 3.0 1.2.5.1正交试验的结果

1号试验结果 编号7试管 1 2

B氮源浓度 （% 2.0 2.5 3.0 C接种量 （ml） 14 16 18 D pH 5.0 5.5 6.0 A 2.197 2.164 B 2.102 2.148 2.023 平均值 2.150 2.156 2.006 总体均值 2.104 3 1.989 2号试验结果 编试管 1 2 3 3号试验结果 A 2.165 2.112 2.041 B 2.264 2.151 2.131 平均值 2.215 2.132 2.086 总平均值 2.144 编号*--一试管 1 2 3 A 0.183 0.172 0.177 B 0.181 0.176 0.182 B 2.296 0.690 1.765 平均值 0.182 0.174 0.180 平均值 2.018 1.033 1.093 总平均值 0.179 4 号试验结果 编号试管 1 2 3 5号试验结果 编号管 1 2 3 6号试验结果 A 1.739 1.375 0.421 总平均值 1.093 A 0.249 1.686 1.201 B 0.355 2.012 1.135 平均值 0.302 0.849 0.168 平均值 1.305 1.287 1.287 总平均值 1.168 编号、一试管 1 A 1.315 1.274 B 1.295 1.30 总平均值 1.287 2 3 1.292 1.281 7号试验结果 编号、〜试管 1 2

A 1.076 1.067 1.072 B 1.075 1.069 1.081 平均值 1.076 1.068 1.077 总平均值 1.073 3 8号试验结果 编号试管 1 2 3

A 1.875 1.763 1.795 B 1.883 1.729 1.802 平均值 1.879 1.746 1.799 总平均值 1.808 9号试验结果 编号J试管 1 2

A 1.965 1.897 1.997 B 2.016 2.114 1.896 平均值 1.991 2.006 1.947 总平均值 1.981 3 正交表

试验号 OD平均值 2.150 1 2.156 2.006 2.215 2 2.132 2.086 0.182

酶活 (U/mi n.ml) 58.171 58.330 54.367 59.889 57.696 56.480 6.178 5.966 酶活平均值 (U/mi n.ml) 56.956 58.022 3 0.174 6.090 0.180 2.018 4 1.033 1.093 0.302 5 0.849 0.168 1.305 6 1.287 1.287 1.076 7 1.068 1.077 1.879 8 1.746 1.799 1.991 9 2.006 1.947 123.2正交方差分析结果

6.125 54.684 28.661 30.246 9.348 23.800 5.808 35.847 35.371 35.371 29.799 29.585 29.823 51.012 47.478 48.898 53.971 54.367 52.808 53.715 49.129 29.736 35.530 12.985 37.864 Test s of Bet wee n -S u b jects Effe cts

Dependent Variable: 酶活(U/min.ml) Type III Sum of Source df Squares 1Mean Square F 30.466 1098.982 16.494 7.074 89.516 8.779 Sig. .000 .000 .000 .005 .000 .002 Collected Model Intercept TY DY JZL PH Error Total Corrected Total 854 7.064 38539.302 1156.816 496.166 6278.346 615.736 631.227 47717.594 9178.291 ° 8 1068.383 1 38539.302 2 2 2 2 18 27 26 578.408 248.083 3139.173 307.868 35.068

a. R Squared = .931 (Adjusted R Squared = .901) SPSS分析结果整理如下: 方差来源 A B C D 误差 总和 平方和 1156.816 496.166 6278.346 615.736 631.227 9178.291 自由度 2 2 2 2 18 方差 578.408 248.083 3139.173 307.868 F 16.494 7.074 89.516 8.779 显著性 极显著 极显著 极显著 极显著 35.068 27 2 •对实验现象、实验结果的分析及其结论 2.1对实验现象的分析

由于发酵培养基的成分在灭菌的过程中会发生变化，因此培养基的颜色灭菌 前后会有一定的变化。摇瓶培养后，三角瓶中溶液的上方有一圈沉淀物， 说明已 经发生了酶促反应，培养基中已有淀粉酶的存在了。 沸水浴会使酶失活，而样品 管中的酶液与底物在这之前已发生了反应， 而空白管中的底物还来不及反应就已 失活，故空白管中溶液的颜色要比样品管中溶液的颜色浅。 摇瓶培养后三角瓶中 出现了一些球状物，说明培养基已被污染。 2.2对实验结果的分析

2.2.1碳源浓度对发酵产酶的影响 当碳源浓度为2.5%时，淀粉酶的活性最高。 2.2.2氮源浓度对发酵产酶的影响 当氮源浓度为2.5%时，淀粉酶的活性最高。 2.2.3培养基 pH对产酶的影响 当pH为5.5时，淀粉酶的活性最高。 2.2.4发酵时间对产酶的影响

当发酵时间为为72h时，淀粉酶的活性最高。 2.2.5正交试验结果分析

当碳源浓度为2.0%、氮源浓度为2.5%、接种量为16ml、pH为5.5时，淀粉酶的 活性最咼。 226方差分析 碳源浓度、氮源浓度、接种量、pH对酶活的影响都达到了极显著的水平。 2.3结论： 淀粉酶发酵条件的最优组合：碳源浓度为2.0%、氮源浓度为2.5%、接种量为16ml、 pH 为 5.5。 2.实验总结 3.1本次试验的成功之处及其原因分析 本次实验虽然步骤繁多但经过各个小组的分工合作基本都完成了实验要求， 大体上达到了实验的目的，得出了淀粉酶产生菌的发酵条件的最佳方案。 究其原 因我认为有以下几点： ⑴ 小组成员间良好的分工合作，既节约了时间又按质完成了实验。 ⑵老师对实验步骤的耐心讲解。 ⑶ 实验过程中遇到问题时，及时向老师和同学请教，以免犯下不可弥补的错误。 ⑷ 实验过程中按照实验步骤仔细、耐心地进行操作，不急于求成。 ⑸ 课前做了一定的准备。 3.2本次试验的失败之处及其原因分析 本次试验的失败之处在于酶活的测定误差较大，有时会出现负值，有时 A、 B两管的差距会有些大，而且酶活不是很高。这可能是由于我们在操作时一些细 节做得不够，如计时和液体量吸取时的精确性。 此外，在做正交试验时，摇瓶培养后三角瓶中出现了一些球状物， 这说明淀 粉酶产生菌已被污染，这很有可能是由于在无菌操作时出了问题。 3.3对自我的评价 通过本次实验，我深刻地认识到了分工合作的重要性，良好的分工合作有助 于我们更高效地完成实验，而且也让我知道了课前做好预习的重要性， 因为课前 做好了预习有助于跟上老师的节奏，更好地理解实验内容、完成实验。此外，本 次实验还使我深深地体会到了 “细节决定成败”这一句话，因为在本次试验中只 有规范地使用移液枪，精确地计时，才能得到准确的实验结果。另外，由于操作 时没有严格地在无菌条件下进行以致于有两瓶淀粉酶产生菌被污染， 因此如果有 机会重做这个实验，我一定会严格按照实验步骤进行操作，更加地注意一些细节， 争取做得更好。 除此之外，由于本次实验要求对结果进行方差分析， 这也就帮我们巩固了生 物统计学的知识，加强了我们的数据处理能力，体会到生物统计学的重要性。 教师评语及评分： 签名: