新生SD大鼠皮质神经元的体外培养和鉴定

４０２　生ＬＥ　ＴＴＥＲ　　・　斗　ｏ－２４Ｎ。．３　Ｍａ　２０１３ｊ　Ｍａｙ，　ＴＴ　ＳＩＮ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＶＯ１．技　术　通　讯…ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１３．０３．０２５　技术方法　新生ＳＤ大鼠皮质神经元的体外培养和鉴定　芦美玲　，林霓阳　，房晓神　汕头大学医学院　ａ．二。一一级儿科硕士研究生；ｂ．第一附属医院儿科；广东汕头５１５０４１　［摘要］　目的：建立高纯度的新生ＳＤ大鼠皮质神经元原代培养方法。方法：取２４　ｈ内的新生ＳＤ大鼠皮质，用木瓜　酶和ＤＮａｓｅ　Ｉ共同消化，５％胎牛血清终止消化，吹打分离组织获得单细胞悬液，进行细胞计数，用无血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２　种植培养，４　ｈ后换成用无血清Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ配制的维持培养液继续培养，尼氏小体染色和免疫荧光法鉴定神经元的纯　度。结果：培养第１０　ｄ，神经元胞体饱满，结构清晰完整，光晕明显，折光性强，可见粗长的树突和轴突，相邻细胞形　成紧密网状联系，神经元纯度达到９６％以上。结论：经改良和优化，无须添加阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长即能够获　得生长状态良好、高纯度的神经元。　［关键词］　皮质；神经元；细胞培养；大鼠　［中图分类号］Ｑ２５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］　１００９—０００２（２０１３）０３—０４０２—０４　Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｒｅｂｒａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｎｅｗｂｏｒｎ　ＳＤ　Ｒａｔ　ＬＵ　Ｍｅｉ—Ｌｉｎｇ　，ＬＩＮ　Ｎｉ—Ｙａｎｇ　，ＦＡＮＧ　Ｘｉａｏ—Ｙｉ　ａ．Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ　ｏｆ　２０１　１－ｇｒａｄｅ；ｂ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ；Ｓｈａｎｔｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈａｎｔｏｕ　５１５０４１，Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｎｎｉｙａｎｇ＠１２６．ｃｏｎ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｕｈｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｉｌｓ　ｏｆ　ｎｅｗｂｏｒｎ　ＳＤ　ｒａｔ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｃｏｒｔｅｘｅｓ　ｆｒｏｍ　ｎｅｗｂｏｒｎ（１ｅｓｓ　ｔｈａｎ　２４　ｈ）ＳＤ　ｒａｔ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　２　ｍｇ／ｍＬ　ｐａｐａｉｎ　ａｎｄ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ＤＮａｓｅ　Ｉ，ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，ｃｏｕｎｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ．Ａｆｔｅｒ　ｃｕｈｉｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｐｌａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　４　ｈ，ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ，Ｂ２７　ａｎｄ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ．Ｔｈｅ　Ｎｉｓｓｌ　Ｓ　ｓｔａｉｎ—　ｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｎ　１０ｔｈ　ｄａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｏｄｙ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｌｌ，ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｅａｒ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ，ｔｈｅ　ａｘｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｉｃｋ　ａｎｄ　ｌｏｎｇ，ａｄｊａｃｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒｍｅｄ　ａ　ｔｉｇｈｔ　ｍｅｓｈ　ｃｏｎｔａｃｔ．Ａｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｎｅｕｒｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｕｂｕｌｉｎ　ＢⅢａｎｄ　Ｎｉｓｓｌ　Ｓ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｕ—　ｒｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｗａｓ　ａｂｏｖｅ　９６％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ（ａｄｄｅｄ　ＤＮａｓｅ　Ｉ，ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｃｙｔｏ—　ｓｉｎｅ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ－ｆｒｅｅ）ｉｓ　ｃｏｓｔ—ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｈｕｒｅ　ｏｆ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｄｅｘ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈｉｇｈ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ，ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ；ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ；ｃｕｌｔｕｒｅ；ＳＤ　ｒａｔ　神经元体外培养是研究神经系统疾病、神经元　与胶质细胞关系的重要技术。虽然国内外神经元培　养方法已比较成熟，但要获得高纯度的神经元仍有　一１材料和方法　１．１　材料　定的困难。目前为了获得较纯的神经元须加入阿　２４　ｈ内的新生ＳＤ大鼠，不分雌雄，ＳＰＦ级，由汕　糖胞苷抑制胶质细胞的生长”。　，但阿糖胞苷对神经　元有一定的毒性，会抑制其生长，影响培养效果，且　头大学医学院实验动物中心提供。　木瓜酶（１０　ｍｇ木瓜酶粉剂加入５　ｍＬ　ＤＭＥＭ／　Ｆ１２配制成浓度为２　ｍｇ／ｍＬ的木瓜酶溶液，加适量　实验繁琐。我们经过改良和优化，建立了一种简便　的高纯度新生ＳＤ大鼠脑皮质神经元培养方法。　ＤＮａｓｅ　Ｉ过滤，消化时现用现配）、左旋多聚赖氨酸　（５　ｍｇ左旋多聚赖氨酸加入无菌纯水１０　ｍＬ，配制　成５００　ｐ．ｇ／ｍＬ的母液，分装后一２０ｃＣｌ冻存，用时稀释　至５０　ｇ／ｍＬ的工作浓度）（Ｓｉｇｍａ公司）；ＤＮａｓｅ　Ｉ　（Ｍｅｒｃｋ公司）；Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培养基、Ｂ２７添加剂、左旋　谷氨酰胺（Ｇｉｂｃｏ公司）；ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＨｙＣｌｏｎｅ公司）；　收稿日期：２０１２—１１—１３　基金项目：广东省自然科学基金（￥２０１１０１０００５０６５）；２０１１年汕头市　科技计划［汕市财教（２叭１）１３４号］　作者简介：芦美玲（１９８７一），女，硕士研究生　通信作者：林霓阳，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｌｉｎｎｉｙａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ　芦美玲等：新生ＳＤ大鼠皮质神经元的体外培养和鉴定　４０３　兔抗神经元特异１３ｌｌＩ微管蛋白（ａｂ１８２０７）（Ａｂｃａｍ公　司）；ＣＹ３标记的山羊抗兔ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；胎　牛血清、１％甲苯胺蓝、４％多聚甲醛、Ｈｏｅｃｈｓｔ（碧云天　公司）。　大，且分布于整个细胞，因此免疫染色效果较好。神　经元培养第１０　ｄ弃去细胞培养液，用ＰＢＳ洗２次；用　４％多聚甲醛室温固定１５　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗２次，每次５　ｍｉｎ；细胞穿透缓冲液（含０－３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００和３％　ＢＳＡ的ＰＢＳ）作用３０　ｒａｉｎ，加入１：３００稀释的兔抗Ｃ　多抗的ＰＢＳ—Ｂ（含ｌ％ＢＳＡ的ＰＢＳ，ｐＨ７．２）；暗湿盒中　盖玻片：泡酸２４　ｈ，自来水清洗干净，再用双蒸　水清洗数次，无水乙醇或９５％酒精浸泡过夜和储存，　使用时过火烤干。　多聚赖氨酸包被孑Ｌ板：６孔板（Ｃｏｒｎｉｎｇ公司）的　每孔加入８００　Ｌ包被，如放人盖玻片每孔加入　４℃孵育过夜，ＰＢＳ洗３次，每次５　ｍｉｎ；加入１：２００稀　释的ＣＹ３标记抗兔ＩｇＧ的二抗，室温避光孵育３Ｏ　ｍｉｎ，洗３次，每次５　ｍｉｎ；用１：１０００稀释的Ｈｏｅｃｈｓｔ　２００　ｔｘＬ，培养箱中放置０．５～２４　ｈ，回收多聚赖氨酸，　用超纯水洗包好的孔板１～３次后放人培养箱烘干，　待用。多聚赖氨酸的使用次数有限，至无效为止。　种植液１（５０　ｍＬ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２）；种植液２（４５　ｍＬ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２加入５　ｍＬ胎牛血清）；终止消化液　（４７．５　ｍＬ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２加入血清２．５　ｍＬ，工作浓度约　为５％胎牛血清）；维持培养液（５０　ｍＬ　Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培　养基加入１　ｍＬ　Ｂ２７、５００　Ｌ双抗、１２５　Ｌ谷氨酰　胺）。　１．２神经元的原代培养　将新生大鼠（数量根据需要的细胞数及种植需　要的密度而定）用７５％的酒精喷洒消毒，酒精棉球擦　干，断头放入９　ｃｍ的玻璃皿（冰上操作）中的解剖液　中，用弯镊撕开头皮完全暴露颅骨，再用眼剪剪开颅　骨，用弯镊去颅骨完全暴露大脑并取大脑，解剖液中　洗净血液，置于新的９　ｅｍ玻璃皿解剖液中，用弯镊　剥离脑膜血管再分离大脑皮层，再检查剥离未剥干　净的脑膜和血管，置于６　ｃｍ玻璃皿解剖液中　。取　好皮质后用解剖液洗ｌ～３次，吸干解剖液，用眼剪剪　成１　ｍｍ　大小，加入配好的消化酶溶液（木瓜酶加　ＤＮａｓｅ　Ｉ）于３７℃消化约１５　ｍｉｎ，显微镜下观察，如　大量单细胞及组织疏松即可终止消化。每５　ｍｉｎ摇　晃一次，用５％胎牛血清培养基终止消化，静置２～３　ａｒｉｎ，转移上清即单细胞悬液，加入培养基２～３　ｍＬ重　悬，用枪头轻柔吹打１０次，静置２～３　ｍｉｎ，转移细胞　悬液，再加入２～３　ｍＬ培养基，再次轻柔吹打１０次，　静置２—３　ｍｉｎ，转移细胞悬液，剩余的丢弃，用２００目　不锈钢过滤器或７０　ｍ一次性过滤器过滤细胞悬　液，吹打均匀，吸取１０　Ｌ细胞悬液加入１０　Ｌ台盼　蓝均匀混合，取１０　Ｌ在血细胞计数板上计数　。加　入种植液稀释到所需浓度，种板，６孔板７０～１８０万／　孔，１００万／：ＦＬ为较适合的密度　】，４　ｈ后全量换成维持　培养液，此后每３　ｄ换半液。　１．３神经元的鉴定　１．３．１　免疫荧光法”　神经元特异的１３１１Ｉ微管蛋白　在胚胎和出生后的中枢和外周神经系统中表达丰　富，分布在神经元整个细胞中，包括细胞浆、轴突和　树突，是神经元的特异性标志之一。由于其表达量　室温避光孵育１０　ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３次，封片，荧光显　微镜下拍照，在２０倍物镜下随机选取ｌ０个视野范围　内的所有细胞，分别统计阳性细胞数和细胞核数（细　胞总数），计算阳性率（阳性细胞数／细胞核数），阳性　率的平均数代表神经元的纯度　。　１－３．２尼氏鉴定法　尼氏小体是神经元特征性结　构之一，神经元胞体和树突都含有丰富的尼氏小　体。尼氏小体嗜碱性强，被甲苯胺蓝染色后成紫蓝　色，在普通光学显微镜下就能辨别阳性和阴性结果，　取培养第１０　ｄ的神经元去培养基，ＰＢＳ洗２次，用　４％多聚甲醛固定１５　ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３次，每次５　ｍｉｎ，用１％甲苯胺蓝浸染２０～４０　ｒａｉｎ（５０～６０ｏＣ），用蒸　馏水稍洗，加入９５％乙醇迅速分色３０　Ｓ，取出玻片晾　干，用甘油明胶封片，光学显微镜下观看，在２０倍物　镜下随机选取１Ｏ个视野范围内的所有细胞，分别统　计阳性细胞和阴性细胞数，计算阳性率【阳性细胞　数／（阳性细胞数＋阴性细胞数）］，阳性率的平均数代　表神经元的纯度。　２　结果　２．１神经元光镜下观察　用种植液１培养，神经细胞接种于细胞培养板　中，可见大而圆的神经细胞，４　ｈ后神经细胞已基本　上贴壁于包被好多聚赖氨酸的培养板中，不少的神　经元已长出明显的细胞突起，随后可见粗大的轴突　形成；３　ｄ后神经元胞体增大，胞质丰富，胞体折光　性强，光晕明显，突起逐渐延长，形态多样，单极、双　极、多极相互交织成网状；培养至第６　ｄ，突起增多　伸长，粗大，形态多样，相互交织成网状并开始形成　神经细胞网络；培养至第９　ｄ，神经元分化更加成　熟，可见密集的神经元细胞网络。从形态学和鉴定　的结果看出神经元细胞的生长全过程几乎看不到胶　质细胞生长（图１）。用种植液２培养，整个神经元成　熟过程与用种植液１区别不大（图２），但因为血清会　促进胶质细胞的生长，如图２Ａ红色箭头所示，从形　态学上看是铺在神经元下面生长的胶质细胞，这些　胶质细胞使得神经元之间的网状突起结构不清晰，　芦美玲等：新生ＳＤ大鼠皮质神经元的体外培养和鉴定　４０５　细胞）呈阴性。因此可认为，在培养的细胞中，呈紫　蓝色阳性表达的即为神经元细胞，阴性表达的是非　独立研究。而且此方法的成功率高，是培养高纯度　神经元值得推广的一种方法。　另外，我们对比了尼氏染色法和免疫荧光法。　神经元。尼氏染色的阳性率计算方法与免疫荧光鉴　定法相似，分别计数了２Ｏ倍物镜下１０个视野范围内　的所有细胞，阳性率最高为１００％，最低９３．３３％，平　均９６％　尼氏染色无需昂贵的抗体，不需要荧光显微镜等高　级设备就能鉴定神经元的纯度，比免疫荧光法更简　便经济，但鉴定效果一样准确可靠，在鉴定神经元中　值得推广应用。综上所述，我们通过改良和优化，获　得了更为简便和经济的高纯度ＳＤ新生大鼠大脑皮　质神经元培养方法。　３　讨论　皮质神经元原代培养是研究神经系统结构及功　能的重要途径和手段之一。神经元体外培养的成活　率受许多因素的影响。一般来说，取材的动物年龄　越小，成活率越高。多数培养的神经元取自胚胎动　参考文献　［１］辛岗，苏芸，王革非，等．新生ＢＡＬＢ／ｃ小鼠大脑皮质神经元细　物，主要是因为此时轴突和树突还未广泛分支发育，　神经元不易在分离过程中受到损伤。并且在发育的　早期阶段，神经元对靶细胞神经营养的依赖性较低，　脑膜和结缔组织鞘膜也易于分离干净　”。不少研究　采用孕鼠进行　。　，但操作步骤较为复杂，且需要杀死　胞培养方法的建立［Ｊ］．生物技术通讯，２０１１，２２（１）：８５—８８．　［２］　Ａｈｌｅｍｅｙｅｒ　Ｂ，Ｂａｕｍｇａｒｔ—Ｖｏｇｔ　Ｅ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｏｅｏｎｅｘ，ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ａｎｄ　ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ　ｆｒｏｍ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｎｅｗ－　ｂｏｒｎ（Ｐ０．５）Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６，１５３（２）：　３１８—３１９．　母鼠本身才能获得小鼠，成本较高。本实验皮质取　自新生大鼠，节省动物，取材方便，鼠龄明确。　培养基方案常用的有２类，一是用含１０％胎牛　血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２种植神经细胞，４～２４　ｈ后换成含　１０％胎牛血清的Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培养液”　；二是目前使用　最多的，用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２种植神经　细胞，４～２４　ｈ后换成无血清的Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培养液　。　在本实验中，我们提出了新的方案，即用ＤＭＥＭ／Ｆ１２　［３】Ｈａｍａｂｅ　Ｗ，Ｆｕｊｉｔａ　Ｒ，Ｕｅｄａ　Ｈ．Ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉ—　ｎａｓｅ　Ｃ——ｇａｎｍｍ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ——ｉｎ・　－ｄｕｃｅｄ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｎｉｃａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ　Ｔｈｅｒ，　２００５，３１３（３）：１０２７－１０３４．　［４］　田风艳，宁琴，罗小平．大鼠原代皮质神经元无血清培养的影　响因素及优化培养方法叫．实用儿科临床杂志，２０１０，１４：　１０９４－１０９７．　［５］　Ｖｉｅｓｓｅｌｍａｎｎ　Ｃ，Ｂａｌｌｗｅｇ　Ｊ，Ｌｕｍｂａｒｄ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｎｕｃｌｅｏｆｅｅｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｉ￣￣ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｍｏｕｓｅ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ａｎｄ　ｃｏｒ—　ｔｉｃａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｓ　Ｅｘｐ，２０１　１，（４７）：ｅ２３７３．　［６］　司徒镇强，吴军正．细胞培养［Ｍ］．西安：世界图书出版西安有　限公司　２００７：７１—７３．　种植神经细胞，４～２４　ｈ后换成无血清的Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　培养液。采用前２个方案可获得较高纯度的神经　元，但神经元中往往混有胶质细胞，更适合一些允许　部分胶质细胞生长的实验，如在模拟临床新生儿窒　［７］孙琪，徐志伟，敖海清，等．大鼠海马神经细胞体外原代培养　与鉴定［Ｊ１．中药新药与』临床药理，２０１０，（５）：４６１—４６４．　［８］夏源，谈伟君，李伯灵．缺氧海马神经元中Ｋ一（ＡＴＰ）对ｐ５３下游　基因Ｏｔ—ｔｕｂｕｌｉｎ表达的影响［ＪＪ．广东医学院学报，２００９，２７（４）：　３６７—３７０．　息体外试验时，有胶质细胞的支持作用会使得实验　更接近生理条件，使实验更有说服力。但因胶质细　胞的影响，也限制了许多独立因素实验。一般得到　较高纯度的神经元，都是通过阿糖胞苷的作用　。　，影　响神经元的生长，也使实验更繁琐。获得高纯度的　神经元且方法简便是目前神经元培养中最难的一　点。有文献表明，添加阿糖胞苷后神经元纯度分别　［９］Ｓａｔｔｌｅｒ　Ｒ，Ｔｙｍｉａｎｓｋｉ　Ｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅ—　ｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｃｉｔ０ｔ０ｘｉｃｉｔｙ［Ｊ１．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ（Ｂｅｒ１），２０００，７８（１）：３－１３．　［１０］Ｂｒｅｗｅｒ　Ｇ　Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｄｕｈ　ｒａｔ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７，７１（２）：１４３－５５．　［１１］郑志弦，林玲．神经细胞培养理论与实践［Ｍ］．北京：科学出版　社，２００２：７７．　可达９３％和９５％　。而我们采用神经元细胞生长全　过程中不加入血清的方案，不须添加阿糖胞苷就能　获得纯度在９６％以上的生长状态优良的神经元，这　［１２］周晖，毛萌，刘卫平，等．脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑　皮质神经元的保护作用［ＪＪ．华西医科大学学报，２００２，（４）：　５７３—５７６．　种方案培养的神经元更适合进行神经元之间的相关