中性蛋白酶酶解蛋清制备活性肽的研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｈｕｉ　Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００７，３５（１１）：３２５８—３２５９　责任编辑金琼琼责任校对胡剑胜　中性蛋白酶酶解蛋清制备活性肽的研究　金嫘　２，李新华１　（１．沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳１１０１６１；２．辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州１２１００１）　摘要研究了ＡＳ１３９８中性蛋白酶酶解鸡蛋蛋清制备小分子活性肽，确定了酶解的最佳工艺：ｐＨ值８．０，酶解温度６０℃，底物浓度４％，　酶加入量为底物浓度的７％，水解时间４　ｈ。在此条件下，水解度达到２６．１％。用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一１５测定了水解物分子量分布，结果表明：　水解产物中的主要成分是分子量集中在ｌ　３００　Ｄａ的寡肽。　关键词蛋清；中性蛋白酶；活性肽；水解度　中图分类号Ｑ８１６　文献标识码Ａ　文章编号０５１７—６６１１（２００７）１１－０３２５８—０２　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｐｅｐｆｉｄｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｅｇｇ　Ｗｈｉｔｅ　ｂｙ　Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ＪＩＮ　Ｌｅｉ　ｅｔ　ｌ　（Ｃｏｌｌａｅｇｅ　ｏｆ．Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　１　１０１６１）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ＡＳ１３９８　ｎｅｕｔｒ￣ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｆｒｏｍ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｗｅｒｅ　８．０　ｐＨ．６０℃　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，４％ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，７％ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　４　ｈ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｉｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｄｅｇｒｅｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　２６．１％．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆｐｅｐｔｉｄｅ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－１５．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆｍｏｓｔ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　１３００Ｄａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ；Ｎｅｕｔｒａｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ；Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ；Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｄｅｇｒｅｅ　生物活性肽具有免疫调节、激素调节、酶抑制、抗菌以　ｌ５　及抗病毒等多种功能。将蛋清进行酶解获得具有生物活性　的寡肽，具有十分重要的价值。田刚等报道，鸡蛋蛋清经５　种蛋白酶酶解后的小肽混合物均具有免疫增强活性。Ｍａｒｔａ　Ｍｉｇｕｅｌ等报道，胃蛋白酶酶解鸡蛋清得到的水解物具有降　血压的作用。笔者主要研究中性蛋白酶对鸡蛋清蛋白的酶　解作用，以获得分子量较小的寡肽，为开发蛋清活性肽提供　依据。　１材料与方法　齄　苌　１０　加　ｍ　５　５　１．１材料与试剂鸡蛋；ＡＳ１３９８中性蛋白酶（无锡酶制剂　厂）；ＳｅｐｈｄｅｘＧ一１５；标准品：葡聚糖２０００，杆菌肽，维生素Ｂ　１．２试验方法　０　２０　４０　６０　水解时间∥ｍｉｎ　图１不同ｐＨ值下的水解度　１．２．１酶解蛋清制备小肽的方法。将鸡蛋洗净，打开后分离　蛋清，将蛋清用水稀释到一定浓度，用沸水浴加热使之变　性，调节ＤＨ值，然后加入ＡＳ１３９８中性蛋白酶，在一定温度　下水解，水解结束后将水解物在沸水浴内灭酶１０　ａｒｉｎ，再在　４　０００　ｒ／ｍｉｎ下离心２５　ｍｉｎ，得上清液进行冷冻干燥即为蛋　清肽粗品。　１．２．２酶解条件的优化。采用单因素试验依次确定酶解的　ＤＨ值、温度、底物浓度和酶的加入量。　１．２．３水解度的测定。采用ＤＨ．ｓｔａｔｅ法。　琏　饕　１．２．４水解物分子量的测定。采用葡聚糖凝胶过滤色谱法。　２结果与分析　２０　４０　６０　８０　２．１酶解条件的确定　水解时间∥ｍｉｎ　图２　不同温度下的水解度　２．１．１　ｐＨ值。笔者首先考察了酶解反应的最适ｐＨ值，选取　底物浓度为３％，酶加入量为底物浓度的５％，温度为４０℃，　调节ＤＨ值分别为７．０、７．５、８．０、８．５进行水解，结果见图１。　由图１可见，在ＤＨ值为８．０时，水解度最大。　２．１．２温度。选取底物浓度为３％，酶加入量为底物浓度的　５％，调节反应液为确定的最佳ｐＨ值，分别在３０、４０、５０、　６０℃下水解，结果见图２。从图２可以看出，６０℃时水解度　高，中性蛋白酶的活性被部分破坏的缘故。　２．１．３底物浓度。稀释蛋清使底物浓度分别为３％、４％、５％、　６％，酶加入量为５％，在已确定的温度和ｐＨ值下进行水解　（图３）。由图３可见，当底物浓度为４％时，水解度最高。当　底物浓度增加时，使酶与底物作用的几率增加，但当底物浓　度增加到一定值时，由于加热变性使底物黏度过大，从而使　反应难以进行。　最大，而当温度在７０℃时，水解度降低，这可能是温度升　作者简介金嫘（１９７１一），女，辽宁锦州人，在读博士，副教授，从事农产　品的深加工与转化研究。＊通讯作者，教授。　收稿日期２００６一ｌ２－２８　２．１．４酶浓度。利用以上确定的ｐＨ值、温度、底物浓度，选　取酶加入量分别为底物浓度的５％、６％、７％、８％进行水　解，结果见图４。由图４可知，当底物浓度一定、加酶量未达　到饱和时，酶的加入量提高，有利于酶与底物的结合，促进　维普资讯 http://www.cqvip.com ３５卷１１期　２５　金嫘等　中性蛋白酶酶解蛋清制备活性肽的研究　２．２．２蛋清水解物的分子量测定。试验采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一１５　凝胶，标准品葡聚糖２０００（Ｍｒ：２００万Ｄａ）、杆菌肽（Ｍｒ：　２０　１　４２０　Ｄａ）、维生素Ｂ。　（胁＝１　３５０　Ｄａ）的洗脱体积分别是２８、　４８、５０　ｍｌ。酶解蛋清上清液经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一１５分离，洗脱液为　ｐＨ值７．０的磷酸盐缓冲溶液，紫外检测波长Ａ：２２０　ｎｍ。水　ｌ５　解物的洗脱曲线见图６。　ｌ０　５　一　《　水解时间∥ｒａｉｎ　世．　图３不同底物浓度下的水解度　酶解，水解度增大；但酶加入量过大，一是增加成本，二是不　利于后续酶解液的精制。综合考虑，笔者选择加酶量为底物　蛋白质浓度的７％。　２５　２　１４　２６　３８　５０　６２　７４　８６　９８　ｌｌ０　洗脱体积∥ｍｌ　２０　图６蛋清水解物的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５洗脱曲线　由图６可见，蛋清水解物在洗脱体积为２８、４０、５２　ｍｌ时　ｌ５　有吸收峰，而在洗脱体积为５２　ｍｌ处的吸收峰最大，即该物　鐾　７　６　５　４　３　２　１　）０　质在整个混合物中所占的比例较大。根据标准品的洗脱体　积可知，此洗脱体积５２　ｍｌ与维生素Ｂ。　的洗脱体积接近，　ｌ０　维生素Ｂ。　的分子量为１　３５０　Ｄａ，因此可以估计在５２　ｍｌ处　出峰的肽分子量略低于１　３５０　Ｄａ。也就是说，酶解物中含有　５　大量分子量略低于１　３５０　Ｄａ的肽。肽链中氨基酸残基的平　２０　４０　６０　８０　水解时间／／ｍｉｎ　均分子量为１２０　Ｄａ，可以推测此酶解物中的主要成分是由　图４不同加酶量下的水解度　１０个左右的氨基酸组成的肽。另外还含有部分分子量为１　３５０Ｄａ的肽。　２．２蛋清肽的制备和分子量的测定　３结论　２．２．１蛋清肽的制备。根据以上确定的酶解条件，即ＤＨ值　（１）ＡＳ１３９８中性蛋白酶酶解蛋清的适宜反应条件为：　８．０，温度６０℃，底物浓度４％，加酶量７％，对蛋清进行水　ｐＨ值８．０，温度６０℃，底物浓度４％，酶加入量为底物浓度　解，水解２４０　ｍｉｎ，水解度达到了２６．１％。同时测定上清液中　的７％。在最适条件下水解４　ｈ，水解度达到２６．１％，氮的回　的氮含量，求出水解后氮的回收率为７２％。水解度随水解　收率达到７２％．　时间的变化曲线见图５。　（２）用ＡＳ１３９８中性蛋白酶水解蛋清蛋白，水解度达到　２６．１％时，水解产物中的主要成分是分子量略低于１　３５０　Ｄａ　的寡肽，该寡肽约由１０个氨基酸分子组成。此外，水解产物　中还含有少量分子量大于１　３５０　Ｄａ的肽类。　参考文献　［１］田波，迟玉杰，吴非．蛋清蛋白酶改性条件的研究［Ｊ】．食品与发酵工　业，２００３，２９（２）：３０—３２．　鐾　［２］田刚，陈代文，余冰．酶解鸡蛋清小肽对小鼠免疫功能的影响［Ｊ】．中　国畜牧杂志，２００５，４１（５）：１４—１７．　［３１　ＭＡＲＴＡ　ＭＩＧＵＥＬ，ＲＯＳＩＮＡ　ＬＯＰＥＺ－ＦＡＮＤＩＮＯ，ＭＥＲＣＥＤＥＳ　ＲＡＭＯＳ，　ｅｔ　ａ１．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｉｎｔａｋｅ　ｏｆ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ［Ｊ］．　Ｉ　ｊｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，７８：２９６０－２９６６．　水解时间／／ｍｉｎ　图５　ＡＳ１３９８中性蛋白酶对蛋白质的水解作用　・＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－—卜－＋－＋－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜－—卜　（上接第３２４４页）　影响及田间抗病性［ＪＪ．草业学报，２００１，ｌ０（１）：２６—３４．　［２３１董宽虎，王常慧，牧原．干燥方法对苜蓿草粉营养价值的影响　．草　［２６］王克武，陈清，李晓林．施用硼、锌、钼肥对紫花苜蓿生长及品质的　地学报，２００３，１１（４）：３３４—３３７．　影响［Ｊ］．土壤肥料，２００３（３）：２４—２８．　［２４］裴彩霞，董宽虎，范华．不同刈割期和干燥方法对牧草营养成分含　［２７１王立克，洪法水．钼浸种处理对苜蓿各生育期硝酸还原酶活性及营　量的影响［Ｊ】．中国草地，２００２，２４（１）：３２—３７．　养成分的影响［Ｊ】．草业科学，１９９６，１３（５）：４８—４９．　［２５１南志标，李春杰，王赞文，等．苜蓿褐斑病对牧草质量光合速率的