高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸

－＝＝＝１６４　２０１２年８月　第３３卷第８期　食品研究与开发　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏ　检测分析　高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸　韦淑毅　－一，钟其顶　，高红波　，邢江涛ｚ，王道兵　。熊正河：－，王岁楼　・　（１．中国药科大学，江苏南京２１０００９；２．中国食品发酵工业研究院，北京１０００２７）　摘要：建立了高效液相色谱法测定富硒酵母中硒代蛋氨酸的分析方法。采用酶解提取法提取富硒酵母样品中的硒　代蛋氨酸，丹磺酰氯柱前衍生，Ｃ１Ｂ色谱柱（４．６ｍｍｘ２５０ｉｎｍｉ．ｄ．，５　ｍ）分离，以１０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠缓冲液（含４％　Ｎ，Ｎ一二甲基甲酰胺，ｐＨ＝６．５５）和乙腈为流动相进行梯度洗脱，荧光检测（激发波长：３２０　ｎｍ；发射波长：５２３ｎｍ）。硒代　蛋氨酸的检出限为（Ｓ／Ｎ＝３）１　，定量限为（　＝１０）５　。在１　ｍｇ／Ｌ～５０ｍｇ／Ｌ范围内的线性关系良好（Ｒ≥Ｏ．９９９６　ｏ　加标回收率在９１．１２％～１０７．８３％，方法相对标准偏差＜１．２％。本方法具有专属性好，灵敏度高，适用于富硒酵母原料　及相关产品中的硒代蛋氨酸的定量测定。　关键词：富硒酵母；硒代蛋氨酸；丹磺酰氯；高效液相色谱法　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｉｎ　Ｓｅｌｅｎｉｕｍ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ　Ｙｅａｓｔ　ｂｙ　Ｒｅｖｅｒｓｅｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ＷＥＩ　Ｓｈｕ－ｙｉ　一，ＺＨＯＮＧ　Ｑｉ－ｄｉｎｇ　，ＧＡＯ　Ｈｏｎｇ－ｂｏ　，ＸＩＮＧ　Ｊｉａｎｇ－ｔａｏ。，ＷＡＮＧ　Ｄａｏ－ｂｉｎｇ　，ＸＩＯＮＧ　Ｚｈｅｎｇ—ｈｅ　，　ＷＡＮＧ　Ｓｕｉ—ｌｏｕ　，　（１．Ｃｈｉｎａ　Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｅａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００９，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ＆　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１　０００２７，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｉｎ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ－　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｙｅａｓｔ　ｉｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｕｔｉｌｉｚｅｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｆｏｒ　ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｄａｎｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｆｏｒ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｉｔｏｎ，Ｃ１８　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｏｌｕｍｎ（４．６　ｍｍ　ｘ２５０　ｍｍ　ｉ．ｄ．，５　ｍ）ｆｏｒ　ｓｅｐｅｒａｔｉｏｎ，１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ　ｆｏｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ｋｅｘ：３２０　ｎｍ；ｈｅｍ：５２３　ｎｍ）ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ（Ｓ／Ｎ＝３）ｉｓ　１　ｇ／．Ｌ，ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ（Ｓ／Ｎ＝１０）ｉｓ　５　ｇ／Ｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１　ｔｏ　５０　ｍｇ／Ｌ　ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｓ　ａ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ（Ｒ≥０．９９９　６）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｉｓ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｒｏｕｎｄ　９１．１２％一　１０７．８３％，ｔｈｅ　ＲＳＤ＜Ｉ．２％．Ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｓ　ｓｐｅｆｉｃｉｔｉｖｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｅｃｏｎｏｍａｔｉｃ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｙｅａｓｔｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｉｎｇ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉ０ｎｉｎｅ：ｓｅｌｅｎｉｕｍ－－ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｙｅａｓｔ；ｄａｎｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ｈｉｇｅ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　硒（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ，Ｓｅ）是人体必需微量元素，存在于　抗氧化酶和甲状腺素代谢酶的活性中心【Ｉ＿２１，缺硒导　硒化物　，人体吸收后可在体内形成硒储备池［５１。富硒　酵母是被广泛研究的食品硒补充剂『６ｊ，在培养基中加　入无机硒，利用酵母将难吸收的无机硒源转化为易吸　收的有机硒源１７］。Ｃｌａｒｋ等嘲的临床研究证明将富硒酵母　致克山病，合理补硒可有效减少人类及动物罹患癌　症的风险【３Ｊ。蛋氨酸中硫被硒取代后得到硒代蛋氨酸　（Ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳｅＭｅｔ），是生物利用度最高的有机　作者简介：韦淑毅（１９８６一），女（壮），硕士研究生，主要从事富硒酵母　纳入饮食中作为硒补充剂可减少大约５０％的癌症发　病率与死亡率。作为硒代蛋氨酸的最经济来源，富硒　酵母中总硒的７０％～７６％以硒代蛋氨酸的形式存在［９－ｔｑ，　富硒酵母中硒代蛋氨酸的含量对评价其质量与营养　价值具有重要意义。　目前，国外测定富硒酵母中硒代蛋氨酸的方法有　高效液相色谱串联电感耦合等离子体质谱法（ＨＰＬＣ—　中活性成分的检测技术研究。　通信作者ｌ：熊正河（１９５７一），女，教授级高工，研究方向：发酵类食　品标准的研究与制定。　通信作者２：王岁楼（１９６ｌ一），男，教授，博士生导师，工学博士，药　物分析学科食品质量与安全方向。　检测分析　韦淑毅，等：高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸　ＩＣＰ—ＭＳ），高效液相色谱串联质谱法（ＨＰＬＣ—ＭＳ），毛　细管电泳一电化学发光法（ＣＥ—ＥＣＬ）等，国内相关文献　较少。Ｃｈａｓｓａｉｇｎｅ等［１ｌ睬用稀酸提取，ＨＰＬＣ—ＩＣＰ—ＭＳ进　行富硒酵母中有机硒检测；Ｐｏｈｔａｊｋｏ等［　２１采用水溶液　超声提取，ＨＰＬＣ—ＭＳ检测富硒酵母中硒代蛋氨酸；以　上方法采用色谱一质谱联用仪器昂贵，使其应用受到　一定限制。Ｄｅｎｇ等【１３］采用稀酸提取，ＣＥ—ＥＣＬ检测富硒　酵母中硒代蛋氨酸；但电泳方法的重现性不高。考虑　到以上方法的不足以及现实生产应用中对检测方法　的要求——需兼顾准确性与经济性，本实验针对富硒　酵母中硒代蛋氨酸进行分析，采用酶解法进行样品提　取，通过对样品的色谱分离及衍生等条件进行研究，　建立了丹磺酰氯（ＤＮＳ—ｃ１）柱前衍生高效液相色谱一　荧光法测定富硒酵母中硒代蛋氨酸。　１材料与方法　１．１材料与试剂　富硒酵母原料（硒含量２　０００　Ｉｘｇ／ｇ）：安琪酵母有　限公司；硒代蛋氨酸（ｉ＞９８％）：Ｊ＆Ｋ，ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ　ＬＴＤ；　丹磺酰氯（≥９８％）：ＡＣＲＯＳ　ＯＲＧＡＮＩＣＳ；蛋白酶ＸＩＶ：　Ｓｉｇｍａ：乙腈（色谱级）：ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；盐酸（优级纯）、　无水碳酸钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）均为北京化　工厂生产；甲胺盐酸盐（分析纯）：国药集团化学试剂有　限公司；Ｎ，Ｎ一二甲基甲酰胺（分析纯）：西陇化工股份　有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）：上海试剂总厂；实验　用水为Ｍｉｌｌｉ—Ｑ水。　１．２仪器与设备　Ｗａｔｅｒｓ　２６９５高效液相色谱仪配荧光检测器：美国　Ｗａｔｅｒｓ公司；ＷＨ一８６１型旋涡混合振荡器：太仓市科教　仪器厂；ｐＨＳ一３Ｃ型酸度计：上海雷磁仪器厂；ＴＨＥＲＭ　Ｏｓｔａｒ一９５型数显恒温水浴锅：浙江省轻工业研究所；　ＨＣ一３５１８型高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限　公司；ＴＨＺ—Ｑ型台式冷冻恒温振荡器：太仓市华美生化　仪器厂；ＡＢ２０４一Ｎ型万分之一分析天平：Ｍｅｔｔｌｅｒ　Ｔｏｌｅｄｏ。　１．３测定方法　１．３．１标准储备溶液的配制　称取适量硒代蛋氨酸标准品，用Ｍｉｌｌｉ—Ｑ水制成　１．０　ｍｓ／Ｌ的硒代蛋氨酸标准储备液。称取适量１７种常　见氨基酸，用０．１　ｍｏｌ／Ｌ盐酸配成１．０　ｍｇ／Ｌ的氨基酸混　标溶液，以上溶液均置４℃冰箱冷冻保藏㈣。　１．３．２样品前处理条件　１．３．２．１样品提取　称取０．１　ｇ经冷冻研磨的富硒酵母原料（或０．５　ｇ富　硒酵母产品），置于１０ｍＬ离心管中，加入５ｍＬ０．０５ｍｏｌ／Ｌ　磷酸氢钠缓冲液（ｐＨ＝７．４），４０　ｍｇ蛋白酶ＸＩＶ，充分混　匀后于３７℃摇床振摇２４　ｈ。振摇结束后向样品酶解液　中加入０．１　ｍＬ　１．５　ｇ／Ｌ亚铁氰化钾溶液及０．１　ｍＬ　３　ｇ／Ｌ　乙酸锌溶液，充分混匀后在３　０００　ｒ／ｍｉｎ下离心１０　ｍｉｎ，　取上清液待测，用８０　ｍｍｏｌ／Ｌ碳酸钠缓冲液（用１　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣ１调节ｐＨ至９．５）适当稀释，使样品含量在方法线　性范围内。　１．３．２．２样品衍生　取１　ｍＬ稀释后的酶解液于５　ｍＬ离心管中，加入　１　ｍＬ　８０　ｍｍｏｌ／Ｌ碳酸钠缓冲液（ｐＨ：９．５），１　ｍＬ丹磺酰　氯（６．０　ｍｇ／Ｌ，乙腈介质），涡旋混匀，于６０℃水浴避光　衍生２　ｈ，加入０．１　ｍＬ　２０　ｍｇ／ｍＬ盐酸甲胺溶液终止衍　生反应。避光放置１５　ｍｉｎ，０．２２　ｍ有机微孑Ｌ滤膜过滤　上机检测。　取１　ｍＬ系列不同浓度的硒代蛋氨酸标准工作液，　按照如上方法进行衍生。　１．３－３色谱条件　Ｐｕｒｓｕｉｔ　ＸＲｓ　Ｃ１８色谱柱（２５０　ｍｉｎｘ４．６　ｍｍ，５　ｍ）；荧　光检测器：激发光波长：３２０　ｎｍ，发射波长：５２３　ｎｍ；柱　温３０℃；进样量为１０　ｉｘＬ；流动相为乙腈一１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　磷酸二氢钠缓冲液（含４％Ｎ，Ｎ一二甲基甲酰胺ｐＨ＝　６．５５）　Ｊ；流速为１．０　ｍＬ／ｍｉｎ，梯度洗脱程序：（Ｔ，乙　腈％）０　ｍｉｎ，１４％；５　ｍｉｎ，２０％；１０　ａｒｉｎ，２５％；１２　ｍｉｎ，　２５．６％；１５　ｍｉｎ，２５．７％；１９　ｒａｉｎ，２５．９％；２３　ｍｉｎ，２６．５％；　３０　ｍｉｎ，２７％；３４　ｍｉｎ，３０％；３８　ｍｉｎ，４３％；４１　ｍｉｎ，６８％；　４５　ｍｉｎ，６８％；４７　ｍｉｎ，８６％；５２　ｍｉｎ，８６％。　２结果与讨论　２．１样品前处理条件的优化　２．１．１硒代蛋氨酸提取方法的选择　酵母细胞壁主要由Ｂ一葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白　以及丁几质构成，比较了超声水溶液提取法与酶解提　取法的提取效率，前者按Ｃａｓｉｏｔ等【　６１所述操作，后者按　１．３．２节所述操作。结果显示，酶解提取液中硒代蛋氨　酸浓度为水溶液提取液的３０倍，说明富硒酵母中硒代　蛋氨酸主要以蛋白结合形态存在，因此本试验采用酶　解提取法提取游离态及结合态的硒代蛋氨酸。　２．１．２蛋白酶ＸＩＶ用量选择　平行取５份０．１　ｇ富硒酵母原料样品，分别加入５、　１０、２０、４Ｏ、６０　ｍｇ蛋白酶ＸＩＶ，按照实验方法酶解测定，　酶量在５　ｍｇ～４０　ｍｇ时硒代蛋氨酸的面积随酶量增加　而增大，在４０　ｍｇ一６０　ｍｇ时硒代蛋氨酸的面积变化较　小，说明４０　ｍｇ蛋白酶ＸＩＶ已经将结合态的硒代蛋氨　酸完全释放出来，结果如图１，因此本试验采用蛋白酶　韦淑毅，等：高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸　．＝＝　检测分析　ＸＩＶ的用量为４０ｍｇ。　表１不同衍生试剂浓度与衍生时间下所得的加标回收率　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆｓｐｉｋｅｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ＤＮＳ—ＣＩ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　ｔｉｍｅ　整萎　　餮５０００　ｒＩ　一．－．－．＿．Ｉ。　进行了优化，最终在１．３．３色谱条件下，酵母中常见的　１７种氨基酸与硒代蛋氨酸获得了良好分离，图２为１７　种常见氨基酸与硒代蛋氨酸衍生物的色谱图，图３为　酵母样品衍生的色谱图。　２ｏｏ０．Ｏ０　１　８０ｏ．０ｏ　１　６ｏｏ．０ｏ　１　４Ｏ０．０ｏ　１　２０ｏ．０ｏ　８　１　０００．００　ｇ　８００．Ｏ０　６００．Ｏ０　４００．Ｏ０　２００．Ｏ０　Ｏ．０ｏ　一２００．０ｏ　４００．０ｏ　６０ｏ．０ｏ　１０．００　ｌ５．００　２０．００　２５．００　３０．００　３５．００加．００　４５．ｏ０　５０．００　５５．００　－一时间／ｍｉｎ　１．硒代蛋氨酸（Ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）；２．蛋氨酸（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）　图２　１７种常见氨基酸与硒代蛋氨酸混标衍生物的液相色谱图　Ｆｉｇ．２　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｏｆ　１７　ｃｏｍｍｏｎ　ａｍｉｎｏ　ａｄｄｓ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　７００．０Ｏ　６０ｏ．０ｏ　５ｏｏ．ｏｏ　４Ｏ０．０ｏ　３００．ｏ０　２０ｏ．ｏ０　１ｏ０．ｏ０　Ｏ．ｏｏ　８．００　ｌ０．００　１２．０ｏ　ｌ４．０ｏ　ｌ６．０ｏ　１８ｍ　２Ｏ．０ｏ　２２ＪＤｏ　２４．ｏｏ　２６．０ｏ　２８．００　３０．０ｏ　３２．０ｏ　３４．００　３６．ｏ０　３８．００　４０．０ｏ　４２．０ｏ　４４．００　４６．ｏ０　４８．ｏｏ　时间／ｍｉｎ　１．硒代蛋氨酸（Ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）　图３富硒酵母样品衍生的色谱图　Ｆｉｇ．３　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　检溯分析　韦淑毅，等：高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸　２．３方法的线性范围与检出限、定量限　取硒代蛋氨酸储备溶液逐级稀释成１．０、５．０、１０．０、　２０．０、５０．０　ｍｇ／Ｌ的系列标准工作液，按试验方法衍生后　测定，以峰面积Ｙ为纵坐标，质量浓度ｘ（ｍｇ／Ｌ）为横坐　标绘制标准工作曲线。结果表明：在１．０　ｍｇ／【Ｊ～５０．０　ｍｇ／Ｌ　时，硒代蛋氨酸质量浓度与峰面积有良好的线性关系　（ｒ＝０．９９９　６），回归方程ｙ＝１２２　４５９ｘ一４８　８１３，检出限（以　Ｓ／Ｎ＝３计）为１　Ｉｘｇ／Ｌ，定量限（以Ｓ／Ｎ＝１０计）为５　ｇ／Ｌ。　２．４方法的重复性　取同一份富硒酵母样品６份，按照上述方法测定　硒代蛋氨酸含量，方法的相对标准偏差小于１．２％，表　明该方法具有良好的重复性。　２．５加标回收率实验　取富硒酵母样品４份，加入不同量硒代蛋氨酸标　准液，按照试验方法测定，计算加标回收率。由表２可　见，硒代蛋氨酸的加标回收率在９１．１２％～１０７．８３％之间。　表２硒代蛋氨酸加标回收率实验　Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆｓｔａｎｄａｒｄ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｌｏｎｉｎｅ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｅｘｔｒａｔ　２．６富硒酵母样品中硒代蛋氨酸的测定　根据建立的方法对５种不同富硒酵母样品及普通　酵母进行检测，结果见表３。　表３富硒酵母原料及产品中硒代蛋氨酸的测定结果　Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｉｎ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ—　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｙｅａｓｔｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　３结论　本文建立了丹磺酰氯柱前衍生一高效液相色谱法　检测富硒酵母中硒代蛋氨酸的分析方法。重点对样品　提取方法和衍生方法进行了研究。１）样品提取方法研　究：对酶解提取和超声提取富硒酵母中硒代蛋氨酸方　法进行比较，结果表明酶解法测定结果远大于超声水　溶液提取法，并对酶用量进行优化，有效提高了富硒　酵母中硒代蛋氨酸的提取效率。２）硒代蛋氨酸衍生及　分离条件研究：选择丹磺酰氯进行柱前衍生，并对衍　生剂浓度及衍生时间进行了优化，采用磷酸二氢钠　缓冲液和乙腈进行梯度洗脱，硒代蛋氨酸与富硒酵母　中常见氨基酸及其它基质干扰组分得到有效的分离；　方法加标回收率在９１．１２％～１０７．８３％之间，相对标准　偏差＜１．２％。该方法相对于液相色谱一ＩＣＰ质谱法，普　及性强，操作简单，兼顾准确性和经济性等特点，适合　运用于实际生产对富硒酵母中硒代蛋氨酸进行定量　分析。　参考文献：　［１】Ｒａｙｍａｎ　Ｐ　Ｒ．Ｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｈｅａｌｔｈ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，　２０００，３５６（９）：２３３—２４１　［２］Ｂｉｒｒｉｎｇｅｒ　Ｍ，Ｐｉｌａｗａ　Ｓ，Ｆｌｏｈ６　Ｌ．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］．　Ｎａｔ　Ｐｒｏｄ　Ｒｅｐ，２００２，１９（６）：６９３—７１８　［３］Ｒａｙｍａｎ　Ｐ　Ｒ．Ｔｈｅ　ａｒｇｕｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｉｎｔａｋｅ【ＪＪ．Ｐｒｏｃ　Ｎｕｔｒ　Ｓｏｃ，２００２，６１（２）：２０３—２１５　［４］Ｓｃｈｒａｕｚｅｒ　Ｃ　Ｎ．Ｔｈｅ　ｎｕｔｉｒｔｉｏｎａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｃｏｌ—　ｏｇｙ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎ０ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ【ＪＪ．Ａｄｖ　Ｆｏｏｄ　Ｎｕｔｒ　Ｒｅｓ，２００３，４７：７３－１　１２　［５］ＷＡＮＧ　Ｚｉｊｉａｎ，ＺＨＯＵ　Ｊｉｅ，ＰＥＮＧ　Ａｎ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｓｉｍｉｌ－　ａｒｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｉｎ　ｂｌｏｏｄ　ａｎｄ　ｂｒａｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ　Ｔｒａｃｅ　Ｅｌｅｍ　Ｒｅｓ，１９９２，３３（１）：１３５—１４３　［６］Ｒｅｙｅｓ　Ｌ　Ｈ，Ｅｎｅｉｎａｒ　Ｊ　Ｒ，Ｍａｒｃｈａｎｔｅ—Ｇａｙ６ｎ　Ｊ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｂｉｏａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｉｎ　ｓｅｌｅｎｉｚｅｄ　ｙｅａｓｔ　ａｆｔｅｒ’’ｉｎ　ｖｉｔｒｏ”ｇａｓ—　ｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ，２００６，１　１　１０（１）：１０８—１　１６　［７］　Ｓｍｉｔｈ　Ａ　Ｍ，Ｐｉｃｃｉａｎｏ　Ｍ　Ｆ．Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｂｉｏａｖａｉｌｂａｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｏ—ｃｏｎ—　ｐｏｕｎｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｒａｔ　ｆＪ１．Ｊ　Ｎｕｔｒ，１９８７，１　１７（４）：７２５—７３１　【８］　Ｃｌａｒｋ　Ｌ　Ｃ，Ｃｏｍｂｓ　Ｇ　Ｆ，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ　Ｂ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｋｉｎ［Ｊ］．Ｊ　Ａｍ　Ｍｅｄ　Ａｓｓｏｃ，１９９６，２７６（２４）：１９５７—１９６３　［９］Ｋｏｔｒｅｂａｉ　Ｍ，Ｂｉｒｄ　Ｓ　Ｍ，Ｔｙｓｏｎ　Ｊ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｂｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｉｏｎ－ｐａｉｒ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏ－　ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｐｌａｓｍａ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙｒ　ａｎｄ　ｂｙ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ　ｅｌｅｅｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙｒ［Ｊ］．Ｓｐｅｃ—　ｔｒｏｃｈｉｍＡｃｔａＰａｒｔＢ，１９９９，５４（１１）：１５７３—１５９１　［１０］Ｌａｒｓｅｎ　Ｅ　Ｈ，Ｈａｎｓｅｎ　Ｍ，Ｆａｎ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｏａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，　ｓｅｌｅｎｏｎｉｕｍ　ｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｂｙ　ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ＨＰＬＣ　ｗｉｔｈ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｉｒｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｙｅａｓｔ　ａｎｄ　ａｌｇａｅ　［ＪＪ．Ａｎａｌ　Ａｔ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２００１，１６（２）：１４０３—１４０８　［Ｉ　ｉ】Ｃｈａｓｓａｉｇｎｅ　Ｈ，Ｃｈ６ｒｙ　Ｃ　Ｃ，Ｂｏｒｄｉｎ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｅｗ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ—ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｙｅａｓｔ　ｍａｔｅｒｉｌａ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ，２００２，９７６（１）：４０９—４２２　［１２］Ｐｄａｔａｊｋｏ　Ａ，ｌｉｗｋａ—Ｋａｓｚｙ＾ｓｋａ　Ｍ，Ｄｅｍｏｖｉｃｓ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｅｌｅｎｉｚｅｄ　ｙｅａｓｔ『Ｊ］．Ｊ　Ａｎａｌ　Ａｔ　Ｓｐｅｃ－　ｔｒｏｍ，２００４，１９（１）：１　１４—１２０　［１３］ＤＥＮＧ　Ｂｉｙａｎｇ，ＳＨＩ　Ａｉｈｏｎｇ，Ｌｉ　Ｌｉｎｑｉｕ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｏｍ—　ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｉｎ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ—ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｙｅａｓｔ　ｕｓｉｎｇ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ－　２０１２年８月　食品研究与开发　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｎｍｅｎｔ　检测分析　．＝＝ｌ６８　第３３卷第８期　种测定口香糖中Ｖｃ的方法　邓鸿铃　（广东食品药品职业学院食品科学系，广东广州５１０５２０）　摘要：针对目前国标没有口香糖中Ｖ　含量的检测方法，结合已有国标Ｖ　测定方法的基础上进行改良试验。对口香　糖样品进行快速溶解，使样品中的ｖ　溶解进入含有乙酸的溶液中，与固蓝盐Ｂ反应生成黄色的草酰肼一２一羟基丁酰　内酯衍生物。在其最大吸收波长４２０ｎｍ处，用紫外可见分光光度计测定其含量。本方法的线性范围１￣ｇ，／ｍＬ￣２０Ｉｘｇ／ｍＬ，　检出限为１　ｐ，ｇ／ｍＬ，样品加标回收率在９０．９％～９８．６％，相对标准偏差为１．５７％。　关键词：紫外可见分光光度计；Ｖ　；口香糖　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｖｃ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｅｗｉｎｇ　Ｇｕｍ　ＤＥＮＧ　Ｈｏｎｇ—ｌｉｎｇ　（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０５２０，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｏ　ｃｈｅｗｉｎｇ　ｇｕｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｎａｔｉｏｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｔｈｅ　ｎａｔｉｏｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉＳ　ｒａｐｉｄ　ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｕｍ　ｓａｍｐｌｅｓ，ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆａｓｔ　ｂｌｕｅ　ｓａｌｔ　Ｂ　ｙｅｌｌｏｗ　ｇｒａｓｓ　ｈｙｄｒａｚｉｄｅ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ　ａｃｉｄ　ｌａｃｔｏｎｅ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ａｔ　ｉｔｓ　ｍａｘｉｍｕｍ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ａｔ　４２０　ｎｍ，ｕｓｉｎｇ　ＵＶ－Ｖｉｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　１　ｐ￣ｇ／ｍＬ一２０　Ｉｘｇ／ｍＬ，ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ　ｗａｓ　１　Ｉｘｇ／ｍＬ，ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　９０．９％ｔｏ　９８．６％，ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ　ｗａｓ　１．５７％．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ；Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ；ｇｕｍ　作者简介：邓鸿铃（１９７７一），男（汉），高级工程师，硕士，主要从事食品安全及食品检测技术的研究工作。　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｍｉｅｒｏｃｈｉｍ　Ａｃｔａ，２００９，１６５（３／４）：２７９—２８３　ｏｆ　ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆＪ】．Ｃｌｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　［１４］Ｐｙｒｚｙｆｌｓｋａ　Ｋ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂｙ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ—　Ａｃｔａ，２００６，３６６（１）：３５２—３５６　ｓｉｓ［Ｊ］．Ｔａｌａｎｔａ，２００１，５５（４）：６５７—６６７　【ｌ９］丁雅韵，谢孟峡，邓志威．丹磺酰氯作为氨基酸柱前衍生试剂衍　［１５】ＣＨＥＮ　Ｔｉａｎｆｅｎｇ，ＺＨＥＮＧ　Ｗｅｎｊｉｅ，ＬＵＯ　Ｙｏｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　生条件的研究［Ｊ］．北京师范大学学报：自然科学版，２００１，３７（４）：　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｓｅｌｅｎｉｕｍ—ｅｎｎｃｈｅｄ　Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ　２５６—２５９　ｐｈａｓｅ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｍａｇ，２００５，　［２Ｏ］Ｋｈｅｄｒ　Ａ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｌａｔｅｎｔ　ｉｆｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｏｆｈｅａｌｔｈｙ　７ｆ４１：３２　ａｎｄ　ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ　ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｂ，２０１０，８７８０９１：　［１６］Ｃａｓｉｏｔ　Ｃ，Ｓｚｐｕｎａｒ　Ｊ，Ｌｏｂｉｉｆｓｋｉ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＨＰＬＣ　１５７６—１５８２　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ｂｙ　［２１】Ｍｉｎｏｃｈａ　Ｒ，Ｌｏｎｇ　Ｓ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＣＰ—ＭＳ【Ｊ】．Ｊ　Ａｎａｌ　Ａｔ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，１９９９，１４：６４５－６５０　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ　ｏｆ　ｆｏｒｅｓｔ　ｔｒｅｅ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　［１７】ＢａｒｔｚａｔｔＩＬＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌａｂｅｌｉｎｇｏｆｄｒｕｇｓａｎｄｓｉｍｐｌｅｏｒｇａｎｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｒｕｎ　ｕｓｉｎｇ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｍｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒｏｕｐｓ，ｕｔｉｌｉｚｉｎｇｄａｎｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｉｎＮａ２ＣＯｓ　ｄａｎｓｙｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ【Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ，２００４，１０３５：６３－７３　ｂｕｆｆｅｒ［Ｊ１．Ｊ　Ｐｈａｎｎａｃｏｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，４５（３）：２４７－２５３　【１８】ＫＡＮＧ　Ｘｕｅｊｕｎ，ＸＩＡＯ　Ｊｉｎｇ，ＨＵＡＮＧ　Ｘｉａｏ，ｅｔ　１ａ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｄａｎｓｙｌ　收稿日期：２０１２—０３—１３