丽春红2R-亮绿法在中枢神经纤维束髓鞘染色中的应用

・４９４・　２　生　Ｑ鲞　Ｍｅｄ　Ｊ（）Ｉ　Ｃｏｍｍｕｎｉｅａｔｉｏｎｓ，２００６，Ｖｏ１．２０．Ｎ０．５　丽春红２Ｒ一亮绿法在中枢神经纤维束髓鞘染色中的应用　栗　卓　吕广明　刘　苏　吴辉群　韩　笑　季达峰　（南通大学医学院人体解剖学教研室，神经生物学研究所，江苏省神经再生重点实验室，江苏２２６００１）　摘要　目的：探索一种中枢神经纤维束髓鞘的染色方法。方法：应用丽春红２Ｒ一亮绿双重染色法，对正常ＳＤ　大鼠脊髓组织进行染色。结果：丽春红２Ｒ一亮绿染色后，脊髓白质中神经纤维束轴索、髓鞘呈橙红色，灰质背景呈　淡绿色，其中神经元呈绿色。结论：丽春红２Ｒ一亮绿法是显示中枢神经纤维束的一种简便、迅速、可靠染色法＝　关键词神经髓鞘；神经纤维束；丽春红２Ｒ一亮绿染色法；脊髓　中图分类号Ｒ３２２．８　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｎｃｅａｕ　２Ｒ－ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｇｒｅｅｎ　ｓｔａｉｎ　ｆｏｒ　ｍｙｅｌｉｎ　ｉｎ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ　ｆａｓｃｉｃｕｌｉ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ＬＩ　Ｚｈｕｏ，ＬＵ　Ｇｕａｎｇｍｉｎｇ，ＬＩＵ　Ｓｕ，ＷＵ　Ｈｕｉｇｑｕｎ，ＨＡＮ　Ｘｉａｏ，儿Ｄａｆｅｎｇ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎａｔｏｍｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｎａｎｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ　２２６００１）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ａ　ｍｙｅｌｉｎ　ｓｔａｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆａｓｅｉｅｕｌｉ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ（ＣＮＳ），Ｍｅｔｈ－　ｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｕｌｔ　Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　Ｐｏｎｃｅａｕ　２Ｒ—ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｇｒｅｅｎ　ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔａｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｏｎｅｅａｕ　２Ｒ—ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｇｒｅｅｎ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ａｘｏｎｓ　ａｎｄ　ｍｙｅｌｉｎ　ｏｆ　ｆａｓｅｉｅｕｌｉ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｈｉｔｅ　ｍａｔｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｒｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｒａｙ　ｍａｔｔｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｇｒｅｅｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｐｏｎｅｅａｕ　２Ｒ—ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｇｒｅｅｎ　ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｓ　ａ　ｑｕｉｃｋ，ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｍｙｅｌｉｎ　ｓｔａｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆａｓｅｉｅｕｌｉ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒ・　ＶＯＵＳ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｍｙｅｌｉｎ；Ｆａｓｅｉｅｕｌｕｓ；Ｐｏｎｅｅａｕ　２Ｒ—ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｇｒｅｅｎ　ｓｔａｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ；　神经髓鞘普通染色不易着色．需用特殊染色法　Ｃｈｌｏｒｐｅｎｔ（０．２　ｍｌ／１００ｇ体重），腹腔注射麻醉后开胸，　显示，从而观察和判别神经髓鞘损伤的程度。根据不　经心脏灌注，先用３７ｏＣ　２００ｍｌ的生理盐水冲净血　同病理状态神经髓鞘的组织结构特点，本研究运用　液．再用预冷的含４％多聚甲醛的０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓　丽春红２Ｒ一亮绿染色法…对正常大鼠不同节段脊髓　冲液５００ｍｌ（ＰＢ，ｐＨ７．４）快速灌注固定．１小时后取　组织进行染色观察，探索中枢神经系统神经髓鞘的　脑和脊髓放入含４％多聚甲醛的ＰＢ中固定４～６小　染色方法，为中枢神经损伤和修复研究奠定基础。　时（４￣Ｃ），再移入含３０％蔗糖的ＰＢ（ｐＨ７．４）溶液中４ｃ【＝　１材料与方法　过夜，沉底后取脊髓第５颈段、第１０胸段、第３腰段　１．１　材料　（１）动物：健康　成年ＳＤ大鼠６只．清洁　以及第２骶段脊髓组织块进行横断面（３只）和纵切　级，体重２５０～３００ｇ，雌雄不拘。由南通大学实验动物　面（３只）冰冻切片（Ｌｅｉｃａ　ＣＭ１９００，Ｇｅｒｍａｎｙ）．片厚　中心提供。（２）试剂：①１％丽春红２Ｒ染色液：丽春红　ｌ０　ｍ，直接贴于预先涂有明胶的载玻片上，置室温　２Ｒ　１ｇ，冰醋酸ｌｍｌ，双蒸水９９ｍｌ，充分溶解即可使　下晾干备用。　用；②２．５％磷钨酸溶液：磷钨酸２．５　ｇ，双蒸水１００ｍｌ；　１．２．２染色步骤：（１）切片经蒸馏水浸洗；（２）丽春红　③１％亮绿ＳＦ染色液：亮绿ＳＦ　ｌｇ，冰醋酸ｌｍｌ，双蒸　２Ｒ　染色液染色５ｍｉｎ；（３）蒸馏水洗，再用２．５％磷钨　水９９ｍｌ，充分溶解即可使用。　酸水溶液处理１ｍｉｎ；（４）用１％亮绿ＳＦ染色液进行　１．２方法　复染４ｍｉｎ；（５）用１％冰醋酸溶液分化１０ｓ；（６）双蒸　１．２．１　组织固定及取材：给予大鼠复合麻醉剂　水洗片；（７）常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树　ｌ基金项目】国家自然科学基金重点项目（９０３０７０１３）；江苏省神经再生重点实验室开放课题（ＪＳＫ－０４００３）；江苏省高校自然科学基金项目　（０５ＫＪＢＩ８０１０５）；南通市社会发展基金项目（￥４００５２）资助　ｌ作者简介】栗卓（１９８０－），女，汉族，北京市人，在读硕士研究生。研究方向：神经损伤与修复＝　通讯作者：吕广明．Ｅ—Ｍａｉｌ：ｇｍｌｕｎ．　ｍｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．Ｔｅｌ：０５　ｌ　３－８５８６３５４２　维普资讯 http://www.cqvip.com

通医堂２　鱼生筮２Ｑ鲞筮５其　ｅｄ　Ｊ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２００６．Ｖｏ１．２０．Ｎｏ．５　・４９５・　胶封片，Ｌｅｉｃａ　ＤＭＲ显微镜（Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ１下观察　并摄影。　２　结　果　丽春红２Ｒ一亮绿双重染色后，在大鼠脊髓颈、　胸、腰、骶段横断面切片上，可见脊髓白质中正常神　经髓鞘染成橙红色，呈有规则的圆环状，中央见有染　成红色的轴索，色泽鲜明，对比清晰，在脊髓前索、外　侧索和后索中均匀分布，髓鞘外周的结缔组织纤维　呈淡绿色（图ｌ～３）。在脊髓颈、胸、腰、骶段纵切面切　片上，可见脊髓白质中正常神经髓鞘呈橙红色，波形　弯曲，排列规则、整齐（图４～６）。在脊髓横切面和纵　切面切片上，脊髓灰质背景呈淡绿色，其中可见染成　深绿色的神经元胞体，细胞核清晰（图７～８）　图ｌ～８　见封四　３讨　论　根据形成神经纤维的神经元轴突是否有髓鞘　（ｍｙｅｌｉｎ　ｓｈｅａｔｈ）包裹，神经纤维分为有髓神经纤维和　无髓神经纤维两大类。髓鞘是围绕在轴突周围的呈　规则螺旋排列、高度特化的多层膜性结构，由蛋白质　（约占干重的３０％）和脂质（约占干重的７０％）组成，　主要成分有胆固醇、磷脂和糖脂（脂蛋白或蛋白脂）。　在普通切片标本上，由于经过有机溶剂处理，髓鞘中　大部分脂质被溶解，仅遗留一些不易溶于有机溶剂　的蛋白结构【２１。　中枢神经系统有髓神经纤维的髓鞘是由少突胶　质细胞突起末端的扁平薄膜包裹轴突并反复环绕而　成。常规的染色方法难以区别有髓神经纤维的轴突、　髓鞘、神经膜等各种组分及其相互关系的变化，需用　特殊髓鞘染色法来显示、观察和判别。髓鞘染色方法　有多种，基于不同的原理，或利用媒染剂，或利用油　溶性染料，或利用锇酸与类脂质的特殊反应。常用的　有Ｗｅｌｌ染色法、碳酸锂苏木精染色法、银染法等。　Ｗｅｌｌ染色法操作简单，试剂价格低廉，是显示神经纤　维髓鞘可靠而常用的染色方法．但染色结果对比度　差、步骤多、分化难于掌握【　１：碳酸锂苏木精染色法的　主要缺陷是染色时间长、步骤繁琐、容易脱片，温度　需要控制在５０～５５＂Ｃｆ　；锇酸价格昂贵，浸透性差。　本研究中所使用的丽春红，是一种蛋白质电泳　染色剂，常用在蛋白印迹实验（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）中样品　转膜后的蛋白染色【６１。近年来有文献报道采用丽春红　２Ｒ、水溶性猩红等酸性染料显示正常或病理周围神　经组织髓鞘的方法『７ｌ　１。我们将此方法应用于正常脊　髓组织，亦获得较好的染色效果。这些酸性染料的染　色机制与传统方法截然不同，其机制是由于髓鞘结　构中含有羧基和氨基等离子基团，这些酸性基和碱　性基具有两性游离等电点的特性，即神经组织髓鞘　在酸性染液中呈碱性，带正电荷，能与带负电荷的　酸性染料结合，从而使髓鞘着色：这些酸性染料的应　用使髓鞘染色方法更加完善，染色步骤和操作更加　简便快捷。　本研究应用丽春红２Ｒ一亮绿染色法对脊髓组织　切片进行染色，脊髓白质中神经髓鞘着色鲜明，染色　结果清晰，对比度好，收到了满意的染色效果，为神　经组织的病理诊断及神经损伤与修复研究提供了较　好的染色方法。　参考文献　【１】田玉旺，李琳，李丽，等、神经髓鞘染色新方法的建立及其　原理探讨【Ｊ１、中国组织化学与细胞化学杂志，２００４，１３（４）：　５４３—５４５．　【２】顾晓松主编．人体解剖学【Ｍ】、北京：科学出版社，２００４、２９８．　【３】徐媛，王钰．提高Ｗｅｌｌ髓鞘染色效果的方法【Ｊ１．沈阳医学　院学报，２００２，４（２）：１０８—１０９．　【４】凌启波主编．实用病理特殊染色和组化技术【Ｍ】．广州：广　东高等教育出版社．１９８９．１５８．　【５】郑辉，沈明，杨晓静．微波技术在髓鞘染色中的庀ｒｅ［Ｊ］．临　床与实验病理学杂志，１９９９，１５（２）：１８２、　【６】Ｇｏｔｚｍａｎｎ　Ｊ，Ｇｅｍｅｒ　Ｃ．Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　Ｐｏｎｃｅａｕ　ｒｅｐｌｉｃａｓ　ｆｒｏｍ　ｂｌｏｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ【Ｊ１　．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０００，２　１（３）：５２３－５２５．　【７】田玉旺，丁华野，冷咏梅，等．丽春红２Ｒ一亮绿染色法在显　示神经髓鞘中的应用【Ｊ１．中国组织化学与细胞化学杂志．　２０００，９（４）：３５８．　【８】田玉旺，丁华野，冷咏梅，等．水溶性猩红一亮绿双重染色法　在显示神经髓鞘中的应用ｌＪ１．中华病理学杂志．２０００，２９（４）：　３１０　维普资讯 http://www.cqvip.com

丽舂红２１ｔ一亮绿法在中枢神经纤维束髓鞘染色中的应用　票卓吕广明刘苏吴辉群韩婆军选峰（见正童第４９５贾　警　擘≮０　　　ｌ・　．　．－‘　。．　。－ｉ　一　０　每　：　。　：　．　围３■■扭娥檀切面　圈４膏焉组织纵ｔ）Ｉ面　时常中种缝髓　轴索　幡红色　２【】　前常中钟经雠　、袖索‘　慨　也　２ｏ　‘●　鬻童季蔓　≤　≤　一　．　崮　胥西龃蛆蚍切面　Ｌ　’　ｎ　挚　盥　毋曩胡蜘蚺切面　卟州索　｝一　髓鞠　轴爆‘ａ静　也　加　富・｝・冲　髓鞘．轴寮　圈７瞢ＩＩＩ§漕　切面　目　脊－越摄幢切西　Ｉ１＿Ｉ响　琦什　｜＿呈　生＾ｊ！）　１¨舶　☆忡　ｌＬ　埔色　帅