朱丽利;杨德圣;朱彪;赵刚
【摘 要】Objective:To investigate the effects of liraglutide (LRG),a type of glucagon-like peptide-1 analogs,on osteoblast differentiation of dog-derived BMSCs and related signaling mechanisms.Methods:BMSCs of dogs were extracted and cultured.The growth curves in different dose of LRG administration were measured by MTT method.After cultured in
osteogenic differentiation medium,ALP activity was tested to choose the optimum dose of LRG administration,qRT-PCR was used to evaluate the expression levels of Runx2、COL-Ⅰ and OCN,phosphorylation levels of PI3K and Akt were detected by Western blot.Results:Different dose of LRG had no influence on the growth of BMSCs;LRG promoted ALP activity in a dose-dependent manner;LRG could significantly up-regulate mRNA expression of Runx2 and COL-Ⅰ (P＜ 0.05),trended to elevate OCN mRNA levels;phosphorylation levels of PI3K and Akt significantly increased by LRG intervention (P＜0.05).Conclusion:LRG promotes osteoblast differentiation of BMSCs by activating PI3K/Akt signaling pathway.%目的:探讨胰升血糖素样肽-1(GLP-1)类似物利拉鲁肽(LRG)对犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响及相关的信号机制.方法:分离、培养犬BMSCs,MTT法检测不同浓度LRG对BMSCs增殖的影响,碱性磷酸酶(ALP)活性检测筛选最佳的LRG干预浓度,实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测成骨相关基因Runx2、COL-Ⅰ和OCN的表达,Western blot检测PI3K、Akt的磷酸化水平.结果:不同浓度的LRG对BMSCs的生长曲线无影响;LRG呈浓度依赖性地增强ALP活性;LRG显著上调Runx2和
COL-Ⅰ的表达(P＜0.05),OCN的表达也呈上升趋势;LRG显著提高PI3K和Akt的磷酸化水平(P＜0.05).结论:LRG可通过激活PI3K/Akt信号通路促进BMSCs骨向分化.
【期刊名称】《口腔颌面修复学杂志》 【年(卷),期】2018(019)001 【总页数】4页(P44-47)
【关键词】胰升血糖素样肽-1;利拉鲁肽;骨髓间充质干细胞;成骨细胞 【作 者】朱丽利;杨德圣;朱彪;赵刚
【作者单位】武警总医院口腔医学中心 北京100039;解放军第306医院全军口腔疾病诊疗中心 北京100101;武警总医院口腔综合科 北京100039;武警总医院口腔综合科 北京100039;武警总医院口腔综合科 北京100039 【正文语种】中 文 【中图分类】R780.2
胰升血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种多肽类激素，因具有多靶点的血糖依赖性降糖作用，在糖尿病治疗中备受关注。但天然GLP-1很快就会被二肽基肽酶IV所降解。利拉鲁肽(liraglutide,LRG)是一种合成的GLP-1类似物，在体内具有较高的酶稳定性，血浆半衰期更长。研究显示[1,2]，GLP-1类似物可调节骨形成与骨重构，并通过激活GLP-1受体促进骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化。但LRG对犬BMSCs骨向分化的影响及其作用机制尚不清楚。因此本研究拟以犬BMSCs
为研究对象，观察LRG对BMSCs骨向分化的作用并探讨其信号机制。 1.材料与方法
1.1 主要材料、试剂与仪器 12月龄雄性Bea-gle犬1只，购自于军事医学科学院实验动物中心。LRG(诺和诺德，丹麦)；α-MEM培养基、高糖DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(HyClone，美国)；胰蛋白酶、β-甘油磷酸钠、左旋维生素C、地塞米松、L-谷氨酰胺(Sigma，美国)；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(南京建成)；一抗[PI3K抗体，磷酸化(p)-PI3K抗体](Bioworld，美国)、Akt抗体，p-Akt抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗(CST，美国)。
MCO-15AC型CO2恒温培养箱(三洋株式会社，日本)；SW-CJ-1FD型生物净化工作台(苏州安泰)；5702R型低速离心机、Biophotometer核酸蛋白测定仪(eppendorf，德国)；340型酶联仪(BDSL，英国)；DYY-7C型电泳仪、DYCZ-40型转膜仪(六一)；BX53型正置荧光显微镜(奥林巴斯，日本)。
1.2 全骨髓贴壁法分离培养BMSCs 无菌条件下抽取犬骨髓液5ml，肝素抗凝。 将骨髓液后与等体积PBS缓冲液混和均匀，1200rpm×5min离心，弃上清；5ml PBS液重悬细胞，1200rpm×5min再次离心，弃上清。然后用α-MEM培养液(含100 ml/L胎牛血清，100U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素)重悬细胞沉淀，接入25 cm2培养瓶，置于CO2恒温培养箱中(5%二氧化碳，100%饱和湿度)培养。待细胞长满约70%-80%时，进行传代扩增。
1.3 细胞增殖能力检测 将P3代BMSCs制成单细胞悬液备用。将BMSCs以2.0×103/孔的细胞密度接种于96孔板，每1-2d更换培养液。细胞分组：培养液中分别加入0nmol/L(对照组；Vehi)、25nmol/L(低浓度组；L-LRG)、
50nmol/L(中浓度组；M-LRG)和 100nmol/L(高浓度组；H-LRG)LRG。接种24h后开始检测，连续检测10d。检测方法参考既往报道[3]。
1.4 ALP活性定量检测 将BMSCs以5.0×103/孔的细胞密度接种于96孔板。待
细胞长满约80%时，换为成骨诱导液培养。细胞分组方法同1.3，分别于诱导培养后第1、3、5、7天，行ALP活性定量检测(每组5个复孔)，检测方法参考既往报道[3]。因为H-LRG组的实验效果优于其它两组，故本研究选取100nmol/L作为最适药物干预浓度。
1.5 qRT-PCR检测成骨相关基因 成骨诱导液培养加入或不加入100 nmol/L LRG。诱导培养3d后提取两组细胞的总RNA，再将RNA反转录为cDNA并进行扩增，扩增条件为94℃预变性3min，94℃变 30s ec，59℃退火 30sec，72℃延伸 45sec，扩增40个循环，最后72℃延伸10 min。检测以下成骨相关基因：Runx2、I型胶原(collagen type I，COL-I)和骨钙素(osteocalcin，OCN)。基因引物序列见附表。
附表 qRT-PCR引物序列注：F，forward，正向；R，reverse，反向。?
1.6 Western blot检测p-PI3K、p-Akt的表达量 将P3代BMSCs以6.0×106/孔的细胞密度接种于24孔板，待细胞长满约80%时，加入成骨诱导液培养24h。然后将细胞分为3组(每组3个复孔)进行药物干预：Vehi组，H-LRG组、HLRG+exendin(9-39)[GLP-1受体抑制剂]组或者H-LRG+LY294002[磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂组]。加药顺序：先加exendin(9-39)[100nmol/L]或LY294002(50μmol/L)预处理30min，然后加入LRG。加药后继续使用成骨诱导液培养48h，然后检测目的蛋白的表达量。
1.7 统计学分析 使用GraphPad Prism 5.0软件对所有数据(均数±标准差，
mean±SD)进行单因素方差统计分析，检验水准α=0.05。实验步骤至少重复3次。 2.结果
2.1 BMSCs形态学观察 BMSCs原代培养2d后即有少量细胞贴壁，呈集落样生长，细胞形态不规则。5d后贴壁细胞集落数明显增多。约7d后细胞长满瓶底约70%-80%，开始进行传代。传代后细胞增殖较快，3-5d即可长满瓶底80%-90%，细
胞呈长条状纺锤形，整体排列呈旋涡状(图1)。 图1 BMSCs生长情况 40×
2.2 BMSCs生长、增殖情况 BMSCs生长曲线测定结果显示：各组细胞生长趋势均呈“S”型，第6-7d增殖速度最快，第9d进入平台期(图2)。与Vehi组细胞相比，加入各LRG对BMSCs的增殖趋势均无显著影响。 图2 BMSCs生长曲线
2.3 ALP活性定量检测 各组细胞ALP活性约在第3-5d达到峰值，第7d时OD值已经回落。加入LRG能显著增强细胞的ALP活性，其中高浓度LRG(100nmol/L)的促进作用最为明显(图3)。
图3 各组细胞ALP活性检测*表示与Vehi组比较P＜0.05，# 表示P＜0.05 2.4 成骨相关基因的转录水平 qRT-PCR检测结果表明：LRG明显增强成骨相关基因Runx2和COL-I的转录表达，差异有统计学意义(P＜0.05)；而不影响OCN的表达水平(图4)。
2.5 PI3K、Akt的磷酸化水平 Western blot结果如图5，与Vehi组相比，LRG显著升高p-PI3K的相对水平(P＜0.05)；加入exendin(9-39)后，p-PI3K/PI3K比例下降，但仍高于Vehi组，差异有统计学意义(P＜0.05)。同时，LRG显著升高p-Akt的相对水平(P＜0.05)；加入 LY294002后，p-Akt/Akt比例下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。
图4 成骨相关基因转录水平*表示P＜0.05 图5 LRG对PI3K/Akt磷酸化水平的影响 3.讨论
本研究以LRG干预骨向诱导分化的BMSCs为模型，观察到LRG可在不影响BMSCs增殖能力的前提下，提高BMSCs的ALP活性，上调成骨相关基因的表达，并发现这种促进作用与激活PI3K/Akt信号通路有关，从而证实LRG能在体外促
进BMSCs骨向分化。
GLP-1类似物是临床上广泛应用的新型降糖药，可呈血糖依赖性地刺激胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌。除了降低血糖，GLP-1类似物还具有广泛的胰腺外作用，例如改善肝脏脂质堆积并减轻体重、保护心血管、降低脑积水模型的颅内压等，那些生物学效应均与激活GLP-1受体有关[4-6]。研究显示，BMSCs和未分化成熟的成骨细胞表达GLP-1受体，但已分化成熟的成骨细胞上不存在此型受体[7-9]。本实验 Western blot结果显示，LRG显著提高胞内PI3K的磷酸化水平；但当加入足量 GLP-1受体抑制剂exendin(9-39)后，PI3K的磷酸化水平仍明显高于Vehi组。这提示LRG也可通过非受体途径激活PI3K，这与Ban等[10]的研究结果类似，Ban等[2]发现GLP-1可通过GLP-1受体依赖途径和非受体依赖途径发挥心脏保护作用。文献报道[2]，GLP-1类似物调节骨代谢的作用部分是通过激活PI3K/Akt信号通路转导的。PI3K被磷酸化激活后，可催化磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)的产生。PIP3产生后，通过与Akt的PH结构域结合，将其锚定于质膜而使其活化。活化的Akt具有调节代谢、促进细胞生存等多种作用。本实验Western blot结果也显示，LRG可激活Akt，加入足量PI3K抑制剂LY294002后，Akt的磷酸化水平显著下降。总而言之，本研究发现PI3K/Akt信号通路参与了LRG促进BMSCs骨向分化的信号转导。
Runx2是成骨细胞特异性表达的转录因子，在骨组织形成的过程中发挥着重要作用[11]。本研究qRT-PCR结果显示，LRG激活PI3K/Akt信号通路后，促进Runx2的转录表达。而启动Runx2的转录表达能促进骨基质蛋白的表达，这些骨基质蛋白主要包括：COL-I，OCN，ALP和骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)等。Col-I为 BMSCs成骨分化的早期标志，而OCN则是BMSCs成骨分化的晚期标志[12]。本研究qRT-PCR结果还发现，LRG激活PI3K/Akt信号通路后，COL-I的转录水平显著上升，OCN的转录水平也呈上升趋势。产生这种差异的原因是：
本实验选择进行qRTPCR实验的时间是在成骨诱导后3d，而这一时段尚处于BMSCs骨向分化早期，因此晚期分化标志OCN表达上调并不明显。
骨源性ALP是一种可直接反映成骨细胞活性或功能状态的表型标志物。本实验表明，LRG可呈浓度依赖性地增强BMSCs的ALP活性。同时MTT结果显示，LRG并不能促进BMSCs的增殖。而王春雷等[13]的研究发现，不同浓度的GLP-1对BMSCs增殖的影响有显著性差异，这与本实验的研究结果不一致。这种差异是由于使用的试剂不同，BMSCs的来源不同等因素造成的。
本研究发现LRG能在体外促进BMSCs骨向分化，因此应用LRG是临床上改善颌面骨量不足的一种潜在方法，尤其适用于颌面骨量不足伴发2型糖尿病或肥胖患者。 参考文献
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