LRIG1对胶质瘤细胞中表皮生长因子受体的抑制作用及其机制

第３８卷第１期第４９页　华中科技大学学报（医学版）　Ｖｏ１．３８　Ｎｏ．１　Ｐ．４９　２００９年２月　Ａｃｔａ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ　Ｓｅｉ　Ｔｅｅｈｎｏｌ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｆｅｂ．　２００９　ＬＲＩＧ１对胶质瘤细胞中表皮生长因子　受体的抑制作用及其机制　＊　叶　飞　高庆蕾　徐同江　雷　霆　华中科技大学同济医学院附属同济医院　神经外科　妇产科，武汉４３００３０　摘要　目的验证ＬＲＩＧ１在胶质瘤细胞中对表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）的抑制作用，探讨其作用机制。方法　采　用激光共聚焦显微镜及Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测ＬＲＩＧ１质粒转染前后神经胶质瘤Ｈ４细胞中ＥＧＦＲ和ＬＲＩＧ１的亚细胞定　位和表达情况。结果在Ｈ４细胞中ＬＲＩＧ１低表达，ＥＧＦＲ高表达，均主要为膜表达；转染ＬＲＩＧ１质粒后，ＬＲＩＧ１表达　增强，ＥＧＦＲ表达下降。结论ＬＲ１Ｇ１主要位于胶质瘤细胞膜上，对膜受体ＥＧＦＲ有抑制作用，参与ＥＧＦＲ的负反馈调　节。　关键词ＬＲＩＧ１；　胶质瘤；　表皮生长因子受体；　转染　中图法分类号　Ｒ７３９．４　ＤＯＩ：１０．３８７０／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—０７４１．２００９．０１．０１２　Ｔｈｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＬＲＩＧ１　ｏｎ　ＥＧＦＲ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｇｌｉｏｍａ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈｎｉｓｍ　Ｙｅ　Ｆｅｉ　，Ｇａｏ　Ｑｉｎｇｌｅｉ。，Ｘｕ　Ｔｏｎｇｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，ＴｏｎｇＪｉ　Ｈｏｓｐｉｔｏｌ，Ｔｏｎｇｊｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００３０　Ａｂｓｔｒａｅｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｖａｌｉｄａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＬＲＩＧ１　ｏｎ　ＥＧＦＲ　ｉｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈ－　ｏｄｓ　Ｃｏｎｆｏｃａ１　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔＯ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＦＲ　ａｎｄ　ＬＲＩＧ１　ｉｎ　Ｈ４　ｃｅｉｌｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ＬＲＩＧ１　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＬＲＩＧ１　ｗａｓ　ｌｏｗ　ａｎｄ　ＥＧＦＲ　ｗａｓ　ｈｉｇｈ　ｉｎ　Ｈ４　ｃｅｌｌｓ．　ＬＲＩＧ１　ａｎｄ　ＥＧＦＲ　ｗｅｒｅ　ｍａｉｎｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｏｎ　ｃｙｔｏｍｅｍｂｒａｎｅ　ｏｆ　Ｈ４　ｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒ　ＬＲＩＧ１　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＬＲＩＧ１　ｗａｓ　ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ。ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＦＲ　ｗａｓ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　Ｈ４　ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＬＲＩＧ１　ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｌｏｃａ－　ｔｅｄ　ｏｎ　ｃｙｔｏｍｅｍｂｒａｎｅ　ｏｆ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｈａｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ＥＧＦＲ．ＬＲＩＧ１　ｉＳ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＦＲ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ＬＲＩＧ１；　ｇｌｉｏｍａ；　ｅｐｉｄｅｒｍａ１　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）及其配体构成的信　号系统，受正、负两种反馈信号的复杂调控，这一信　１材料与方法　号网络系统的过度激活可导致肿瘤的发生［】］。在胶　１．１材料　质瘤等恶性肿瘤形成过程中，通过ＥＧＦＲ过表达等　１．１。１胶质瘤细胞系　胶质瘤细胞系Ｈ４细胞来　途径使信号传导过度增强，促进肿瘤的发生和发展。　源于神经胶质瘤，由美国典型培养物保藏中心（Ａ—　长期以来，对该系统的潜在抑制途径研究很少，因而　ｍｅｒｉｅａｎ　ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）提供。用　成为当前肿瘤研究的前沿之一［２］。在该领域，新发　含有１０　胎牛血清（杭州四季青公司）、１００　Ｕ／ｍｌ　现的ＬＲＩＧ１因其直接作用于胞膜上的ＥＧＦＲＬ　，在　青霉素、１００￣ｇ／ｒｎｌ链霉素的ＤＭＥＭ完全培养液在　信号通路起始阶段发挥抑制效应，所以近年来受到　３７℃、５　ＣＯ　，相对湿度９０　９／５的培养箱中培养。　关注，本实验通过对ＬＲＩＧ１在神经胶质瘤Ｈ４细胞　１．１．２　试剂　含野生型ＬＲＩＧ１基因的质粒　中的亚细胞定位和过度表达ＬＲＩＧ１对ＥＧＦＲ影响　ｐ３ＸＦＬＡ　ＣＭｖ９一ＬＲ１Ｇ１由瑞典Ｕｍｅａ大学的Ｎｉｌｓ－　的研究，验证ＬＲＩＧ１对ＥＧＦＲ信号传导通路的抑　ｓｏｎ教授惠赠。限制性内切酶ＫｐｎＩ、ＮｄｅＩ和ＢａｒｎＨＩ　制作用，探讨其作用机制。　均购自ＴａＫａＲａ生物技术有限公司，Ｔ４连接酶购自　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｔａｑ酶购自晶美公司。质粒ｐｃＤ－　国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０６７２１６１，Ｎｏ．３０２７１３３２）　叶飞，男，１９７４年生，医学博士，主治医师　ＮＡ３．１（＋）和含增强型绿色荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅ　ｇｒｅｅｎ　通讯作者，Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）的对照质粒ｐｃＤＮＡ３．１　・　５Ｏ　・　华中科技大学学报（医学版）　（＋）一ＥＧＦＰ由同济医院肿瘤分子医学中心馈赠。兔　抗人ＥＧＦＲ多克隆抗体为Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司产品；兔抗　人ＬＲＩＧ１多克隆抗体为Ｎｉｌｓｓｏｎ教授惠赠；１３－ａｃｔｉｎ羊　抗人多克隆抗体为Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司产品。脂质体Ｌｉ—　ｐｅｒｆｅｃｔｉｍｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｌｕｓ试剂盒购自Ｇｉｂｃｏ公司。　１．２方法　１．２．１　ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＲＩＧ１质粒的构建质粒ｐｃＤ—　ＮＡ３．１（＋）和ｐ３ＸＦＬＡＧ—ＣＭＶ９一ＬＲＩＧ１经ＢａｒｎＨ　工和Ｎｄｅ工酶切、电泳后，分别回收４．６Ｏ　ｋｂ的全长　ＬＲＩＧ１目的片段和４．９６　ｋｂ的ｐｃＤＮＡ３．１载体片　段。经Ｔ　连接酶连接后，连接产物转化入ＤＨｓ　大　肠埃希菌，氨苄西林培养板筛选出ＬＲＩＧ１阳性克　隆，最后用ＢａｍＨ　Ｉ和Ｎｄｅ　Ｉ酶切鉴定得到ｐｃＤ—　ＮＡ３．１－ＬＲＩＧ１重组质粒。将质粒ＤＮＡ大量提取　（Ｏｍｅｇａ公司质粒大提试剂盒）用于细胞转染。　１．２．２　ｐｃＤＮＡ３．１一ＬＲＩＧ１质粒转染胶质瘤细胞　将培养的Ｈ４细胞以１×１０　／ｍｌ接种至６孔板，待　其生长至９０　融合时，应用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｌｕｓ试剂盒按说明书进行转染，分为①对照组　（未处理组）；②转染ｐｃＤＮＡ３．１（空载体）组；③转染　ｐｅＤＮＡ３．１一ＬＲＩＧ１组。６　ｈ后终止转染。　１．２．３应用激光共聚焦显微镜检测ＬＲＩＧ１和ＥＧ—　ＦＲ的表达３６　ｈ后，消化收集细胞，ＰＢＳ洗１遍，　加入一抗ＬＲＩＧ１（１：２００，１　ＢＳＡ）和ＥＧＦＲ（１：　１００，１　ＢＳＡ）４℃过夜，ＰＢＳ洗１遍，加入ＦＩＴＣ标　记的二抗（１：２００，１　ＢＳＡ），３７℃避光孵育３Ｏ　ａｒｉｎ，ＰＢＳ洗１遍，１　多聚甲醛４℃固定３Ｏ　ｍｉｎ，　ＰＢＳ洗１遍，加入ＰＢＳ　２４０　Ｆ１，ＲＮａｓｅ　Ａ　１０“ｌ，ＰＩ　２５０　ｌ，避光处理２Ｏ　ｍｉｎ后上机检测。　１．２．４　蛋白的提取及Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析应用Ｍ—　ＰＥＲＴＭ哺乳动物蛋白提取试剂盒（Ｐｉｅｒｃｅ公司）提　取转染前后的Ｈ４胶质瘤细胞的总蛋白，１２　０００　ｇ　离心１５　ｍｉｎ，将上清转管后于一８Ｏ℃冻存。在８　ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶上电泳，上样量为３０　ｇ总蛋　白。电泳完毕后，使用电转移仪（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）将样品　转移至ＰＶＤＦ膜。含５％脱脂奶的ＴＢＳＴ溶液室温　封闭２　ｈ，分别加入ＬＲＩＧ１兔抗人多克隆抗体（１：　５　０００），ＥＧＦＲ兔抗人多克隆抗体（１：２　０００）和Ｂ—　ａｃｔｉｎ羊抗人多克隆抗体（１：２　０００），４℃过夜。　ＴＢＳＴ漂洗后加入辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的　二抗（１：２　０００）（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司），化学发光法　（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＣＬ）显色（Ｐｉｅｒｃｅ　公司）。运用德国ＬＥＩＣＡ　Ｑ５５０ＩＷ图像分析仪对　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果进行图像分析，计算条带的积分　吸光度（ＩＡ），ＩＡ一平均吸光度×面积。　２００９年２月第３８卷第１期　１．２．５　统计学方法　以上实验均独立重复３次，实　验数据以ＳＰＳＳ　１２．０软件进行统计分析，实验结果　以均数±标准差（　±５）表示，以Ｐ％０．０５为差异有　统计学意义。　２　结果　２．１　ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＲＩＧ１质粒的构建及酶切鉴定　用ＢａｍＨ　Ｉ和Ｎｄｅ工酶切质粒ｐ３ＸＦＬＡＧ—　ＣＭＶ９一ＬＲＩＧ１和ｐｃＤＮＡ３．１（十）载体，分别回收　４．６Ｏ　ｋｂ的全长ＬＲＩＧ１目的片段和４．９６　ｋｂ的　ｐｃＤＮＡ３．１载体片段，连接可得到重组质粒ｐｃＤ—　ＮＡ３．１一ＬＲＩＧ１，经ＢａｒｎＨ工和Ｎｄｅ工双酶切鉴定为　４．６０　ｋｂ和４．９６　ｋｂ的２个片段（图１）。　ｂｐ　１０．４０　６　０００　５　０００　４　０００　猫　３　０００　Ｏ　４４　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（１　ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ）；１：ｐ３ＸＦＬＡ　ＣＭＶ９一　ＬＲＩＧ１质粒；２：ｐ３ＸＦＬＡＧ－ＣＭＶ９一ＬＲＩＧ１质粒经ＢａｒｎＨ　Ｉ和Ｎｄｅ工酶切产物；３：ｐｃＤＮＡ３．１质粒；４：ｐｃＤＮＡ　３．１质粒经ＢａｒｎＨ　Ｉ和Ｎｄｅ　Ｉ酶切产物；５：重组质粒　ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＲＩＧ１经ＢａｍＨ　Ｉ和Ｎ　Ｉ双酶切鉴定为　４．６０　ｋｂ和４．９６　ｋｂ的２个片段　图１重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１一ＬＲＩＧ１酶切鉴定　２．２　应用激光共聚焦显微镜检测ＬＲＩＧ１和ＥＧＦＲ的表达　激光共聚焦显微镜下观察Ｈ４细胞中ＬＲＩＧ１　蛋白表达主要位于胞膜上，表达较弱，而ＥＧＦＲ蛋　白表达位于胞膜及胞质中，表达较强。转染ｐｃＤ—　ＮＡ３．１一ＬＲＩＧ１质粒３６　ｈ后，Ｈ４细胞中ＬＲＩＧ１蛋　白膜表达明显增强，而ＥＧＦＲ蛋白表达明显减弱。　转染ｐｃＤＮＡ３．１空载体组ＬＲＩＧ１和ＥＧＦＲ蛋白表　达无明显变化。红色为细胞核碘化丙啶（ＰＩ）染色，　绿色为蛋白荧光染色（图２）。　２．３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测１ｔ４细胞中ＬＲＩＧ１和ＥＧＦＲ蛋白的表达　在Ｈ４细胞中，转染ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＲＩＧ１组的　ＬＲＩＧ１蛋白表达（１．７９０±０．１１９）较对照组（０．７１７　±０．０３８）和转染空载体组（０．９３０±０．０７６）明显升　高，差异均有极显著性意义（均Ｐ＜０．０１）；而转染　ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＲＩＧ１组的ＥＧＦＲ蛋白表达（０．７０３±　０．０６７）较对照组（１．２８０±０．０７８）和转染空载体组　（１．１６３±０．０６８）明显降低，差异均有极显著性意义　（均Ｐｄ０．０１）（图３）。　叶　飞等．ＬＲＩＧ１对胶质瘤细胞中表皮生长因子受体的抑制作用及其机制　・５１・　Ａ　ａ　ｂ　Ｃ　Ｂ　ａ　ｂ　ｃ　１　■■■■■■　２　■■■■■■　２　３　■■■■■■　３　１：对照组；２：转染ｐｃＤＮＡ３．１空载体组；３：转染ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＲＩＧ１质粒组；ａ：ＦＩＴＣ标记的二抗　在胞膜和胞质所呈现的绿色荧光染色；ｂ：ＰＩ核染；ｃ：ａ和ｂ合并后的直观图像；Ａ：一抗为ＬＲＩＧ１，　显示ＬＲＩＧ１主要位于胞膜上，转染ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＲＩＧ１质粒后染色明显增强；Ｂ：一抗为ＥＧＦＲ，显　示ＥＧＦＲ主要为胞膜和胞质表达，转染ｐｃＤＮＡ３．１一ＬＲＩＧ１后表达明显减弱　图２激光共聚焦显微镜观察ＬＲＩＧ１和ＥＧＦＲ表达　’　１　２　３　一ｌ（】）　ｅｒｉｃｈ等＿３　也发现ＥＧＦＲ和ＬＲＩＧ１有共表达现象。　ＬＲＩＧ１　—　ｌ５１　另外，在激光共聚焦显微镜和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检　测中发现，ＬＲＩＧ１在Ｈ４细胞株中弱表达，ＥＧＦＲ呈　ＥＧＦＲ　—　—　１７０　高表达。有研究应用实时定量ＲＴ—ＰＣＲ进行分析，　６－ａｃｔｉ　—　■　■■—　４２　发现ＬＲＩＧ１　ｍＲＮＡ在多种上皮源性肿瘤细胞系表　１：对照组（未处理组）；２：转染ｐｃＤＮＡ３．１（空　达下调，这种ＬＲＩＧ１表达的下调或缺失可能导致　载体）组；３：转染ｐｃＤＮＡ３．１一ＬＲＩＧ１组　ＥＧＦＲ抑制信号的消失和持续的ＥＧＦＲ活化，导致　图３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ显示胶质瘤Ｈ４细胞中　细胞增殖和肿瘤存活＿６］。本实验通过对Ｈ４细胞转　ＬＲＩＧ１和ＥＧＦＲ蛋白的表　染ＬＲＩＧ１　ｃＤＮＡ证实，过表达ＬＲＩＧ１可以明显下　调ＥＧＦＲ的膜表达和整体蛋白水平。Ｇｏｌｄｏｎｉ等ｌ＿７］　３讨论　也在体外培养的一些癌细胞中发现，ＬＲＩＧ１的外功　当前，对ＬＲＩＧ１作用机制的认识主要是建立在　能区可通过降低ＥＧＦＲ的活性抑制细胞的增殖＿７］。　对ｋｅｋｌ研究的基础上，ｋｅｋｌ由ＥＧＦ诱导产生，通过　ＬＲＩＧ１和ＥＧＦＲ在Ｈ４细胞的膜表达及ＬＲＩＧ１过　和ＥＧＦＲ结合抑制其信号传导通路口］。在ｓｆ９细胞　表达可引起ＥＧＦＲ的表达下调，这一现象为ＬＲＩＧ１　中联合表达Ｍｙｃ标记的ｋｅｋｌ和ＥＧＦＲ或果蝇Ｔｏｒｓｏ　在胞膜对ＥＧＦＲ直接抑制的观点提供了客观依据。　ＲＴＫ，用抗Ｍｙｃ抗体在细胞溶解物中将ｋｅｋｌ免疫沉　Ｇｕｒ＿８　和Ｌａｅｄｅｒｉｃｈ等＿３　在实验中发现，ＬＲＩＧ１可以　淀，用抗ＥＧＦＲ抗体标记ＥＧＦＲ的联合沉淀，结果证　对ＥｒｂＢ家族受体激酶产生负调节并且通过ｃ—Ｃｂｌ　实ｋｅｋｌ与ＥＧＦＲ直接连结在一起。免疫组化分析表　等途径加速ＥｒｂＢ家族受体的泛素化降解，从而对　明ＬＲＩＧ１广泛分布于不同器官的上皮、肌肉和分散　ＥｒｂＢ家族受体抑制。ＥＧＦＲ是ＥｒｂＢ家族受体的　的神经元中；其中，脑的表达水平最高，提示ＬＲＩＧ１　重要成员，ＬＲＩＧ１的过表达所引起的Ｈ４细胞ＥＧ　的神经相关作用ｌ４］。本研究中通过激光共聚焦显微　ＦＲ受体下调这一现象是对Ｇｕｒ等　所得研究结果　镜观察发现，在神经胶质瘤Ｈ４细胞中，ＥＧＦＲ在胞膜　在胶质瘤细胞系中的进一步验证。　和胞质中均有表达，膜表达比胞质表达明显；ＬＲＩＧ１　ＬＲＩＧ１蛋白为人体内源性物质，可能具有较高　分布于胞膜和胞质中，胞膜的着色明显高于胞质。　的特异性，这是以往在针对ＥＧＦＲ传导途径的胶质　Ｎｉｌｓｓｏｎ等『５　分析发现ＬＲＩＧ１的结构和ｋｅｋｌ高度相　瘤研究领域中所欠缺的，关于它在胶质瘤中作用和　似，具有跨膜蛋白样结构。ＥＧＦＲ和ＬＲＩＧ１的膜表达　机制的研究对临床肿瘤治疗具有重要意义。　为使两者在膜水平发生作用提供了可能；最近，Ｌａｅｄ一　（下转第６３页）　徐慧婷等．ＲＮＡ干扰抑制环氧化酶一２表达对宫颈癌ＨｅＩ　ａ细胞增殖的影响　・　６３　・　ｋｕ７０、ｋｕ８０的表达而影响到细胞的增殖。Ｌｉｍ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３。２２（５４）：　８６５３—８６６１．　等＿１　研究发现ＣＯＸ一２抑制剂也可下调ｋｕ７０、ｋｕ８０　［６］　ＰＥＴＥＲＳＥＮ　Ｃ，ＰＥＴＥＲＳＥＮ　Ｓ，Ｍ１Ｉ　ＡＳ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ＿Ｅｎｈａｎｃｅ—　这２种ＤＮＡ修复相关基因的表达。Ｒａｊｕ等　。　的　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｖ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａ　ｓｅ—　ｌｅｃｔｉｖｅ　ｃｙｃｌｏ０ｘｙｇｅｎａｓｅ一２　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ［Ｊ］．　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　实验也不仅在蛋白水平证明ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ抑制ｋｕ７０的　２０００，６（６）：２５１３—２５２Ｏ．　表达，同时证明ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ还可降低ＤＮＡ—ｋｕ的结合　［７３　ＲＡＪＵ　Ｕ，ＮＡＫＡＴＡ　Ｅ，ＹＡＮＧ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｅｎｈａｎｃｅ—　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｅｅｌｌ　ｒａ　ｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｖ　ｂｖ　ａ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　活性。本实验通过ＲＮＡｉ技术抑制ＨｅＬａ细胞　ｃｙｃｌ００ｘｙｇｅｎａｓｅ一２　ｅｎｚｙｍｅ：　ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　Ｏｎｃｏ１　Ｂｉｏｌ　Ｐｈｙｓ，２００２，５４（３）：８８６　８９４．　ＣＯＸ一２表达后，也证实其ｋｕ７０、ｋｕＳ０表达在ｍＲ—　［８３　Ｉ　ＩＮ　Ｍ　Ｔ，ＬＥＥ　Ｒ　Ｃ，ＹＡＮＧ　Ｐ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ　２　ＮＡ和蛋白水平均明显受抑制。　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ｍｃｌ一１一ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ＣＬ１．０　ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉ　本实验成功构建了利用ＲＮＡｉ技术抑制ＣＯＸ一　ｎｏｓｉｔｏｌ　３－ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００１，２７６　２表达的ＨｅＬａ细胞，并进一步探讨了ＣＯＸ－２对细　（５２）：４８９９７—４９００２．　［９］　ＺＨ０Ｕ　Ｘ　Ｍ，ＷＡＮＧ　Ｂ　Ｃ，ＦＡＮ　Ｘ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ＿Ｎｏｎ—ｓｔｅｒｏｉｄａｌ　胞增殖的影响以及可能机制。ＲＮＡｉ抑制ＣＯＸ一２　ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｄｒｕｇ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　表达后，可能通过抑制ｋｕ７０、ｋｕＳ０的表达使细胞增　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｘ　ａｎｄ　ｂａｋ［Ｊ］．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，　２００１，２２（９）：１３９３—１３９７．　殖抑制，说明ｃＯＸ一２在细胞增殖方面具有一定的作　［１ｏ］　ＳＷＡＭＹ　Ｍ　Ｖ，ＨＥＲＺＯＧ　Ｃ　Ｒ，ＲＡＯ　Ｃ　Ｖ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＯＸ一２　ｉｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｂｙ　ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ　ｎｃｒｅａｓｅｓ　ｔｈｅ　ｎｕ—　用。通过ＣＯＸ一２途径影响肿瘤细胞增殖具有一定　ｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｅ　ｐ５３［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００３，６３　的复杂性，中问具体分子机制有待进一步研究。　（１７）：５２３９－５２４２．　［１１］　ＤＡＮＤＥＫＡＲ　Ｄ　Ｓ，ＬＯＰＥＺ　Ｍ，ＣＡＲＥＹ　Ｒ　Ｉ，ｅｔ　ａ１．Ｃｙｃｌｏｏｘｙ　ｇｅｎａｓｅ—‘２　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ　ａｕｇｍｅｎｔｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｄｒｕｇ—－　参　考　文　献　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ－３　ａｎｄ一９　ｉｎ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００５，１１５（３）：４８４—　［１］　ＬＩＡ０　Ｚ，ＭＡＳ０Ｎ　Ｋ　Ａ，ＭＩＬＡＳ　Ｉ　，ｅｔ　ａ１．Ｃｙｃｌｂ－ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２　４９２．　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ：ｉｓ　ｔｈｅｒｅ　ａ　ｒｏｌｅ？［Ｊ］．Ｄｒｕｇｓ，　［１２］　ＣＯＩ　Ｉ　ＩＳ　Ｓ　Ｊ，ＤＥＷＥＥＳＥ　Ｔ　Ｌ，ＪＥＧＧＯ　Ｐ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｌｉｆｅ　２００７，６７（６）：８２１－８４６．　ａｎｄ　ｄｅａｔｈ　ｏｆ　ＤＮＡ—ＰＫＩ　Ｊ　１．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，２４（６）：９４９—９６１．　［２］　ＢＲＵＭＭＥＬＫＡＭＰ　Ｔ　Ｒ，ＢＥＲＮＡＲＤＳ　Ｒ，ＡＧＡＭＩ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．　［１３］　ＥＳＰＥＪＥＬ　Ｓ，ＦＲＡＮＣ０　Ｓ，ＳＧＵＲＡ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎ—　Ａ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｓｔａｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡｓ　ｉｎ　ｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＤＮＡ—ＰＫｃｓ　ａｎｄ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｉｎ　ｔｅｌｏｍｅｒｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６（５５６７）：５５０—５５３．　１ｅｎｇｔｈ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ［Ｊ］．ＥＭＢＯ　Ｊ，２００２，２１（２２）：６２７５—６２８７．　［３］　ＮＡＫＡＴＡ　Ｅ，ＭＡＳＯＮ　Ｋ　Ａ，ＨＵＮＴＥＲ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ＿Ｐｏｔｅｎｔｉａ—　［１４］　ＳＺＵＭＩＥＬ　Ｉ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｄｏ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｃｈｅｍｏｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｓｅ一　ｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋ　ｒｅｐａｉｒ：ｔｈｅ　ｃｅｌｌ’ｓ　ｓｅｌｆ－ｄｅｆｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇ—　［ｅｃｔｉｖｅ　ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ　２　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎｈｉｈｉｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　ｈａｌ，２００６，１８（１０）：１５３７一ｌ５４８．　Ｏｎｃｏ１　Ｂｉｏｌ　Ｐｈｙｓ，２００４，５８（２）：３６９　３７５．　［１５］　ＬＩＭ　Ｊ　Ｗ，ＫＩＭ　Ｈ，ＫＩＭ　Ｋ　Ｈ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｋｕ７０　ａｎｄ　ｋｕ８０　［４］　ＮＡＲＡＹＡＮＡＮ　Ｂ　Ａ，ＮＡＲＡＹＡＮＡＮ　Ｎ　Ｋ，ＤＡＶＩＳ　Ｌ，ｅｔ　ａＩ　＿ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ＮＦ—ｋａｐｐａ　Ｂ　ａｎｄ　ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ一２　ｉｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｙｃｌｏ０ｘｙｇｅｎａｓｅ　２　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｐｒｅ—　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　ｖｅｎｔｓ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：　２００２，２７７（４８）：４６０９３－４６１００．　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｙｎａｐｔ０ｐｈｙｓｉｎ，ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１，ａｎｄ　［１６］　ＲＡＪＵ　Ｕ，ＡＲＩＧＡ　Ｈ，ＤＩＴＴＭＡＮＮ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｈｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ，２００６，５（５）：ｌｌ１７—　ＤＮＡ　ｒｅｐａｉｒ　ａｓ　ａ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｒａ　ｄｊ０ｒｅｓＤ０ｎｓｅ　ｏｆ　１１２５．　ｈｅａｄ　ａｎｄ　ｎｅｃｋ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ａ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２　［５］　ＤＥＮＫＥＲＴ　Ｃ，ＦＵＲＳＴＥＮＢＥＲＧ　Ａ，ＤＡＮＩＥＬ　Ｐ　Ｔ，ｅｔ　ａＩ　．ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　Ｏｎｃｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｐｈｙｓ，２００５，　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇ。／ＧＩ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ　ｉｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　６３（２）：５２０—５２８．　ｂｙ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｄｒｕｇ　ＮＳ－３９８，ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｂｙ　ＣＯＸ一２一　（２００８—０２—２２　收稿）　（上接第５１页）　Ｒｅｓ，２００３，３ｌ２（１）：６５—７１．　参　考　文　献　［５］　ＮＩＬＳＳＯＮ　Ｊ，ＶＡＬＬＢＯ　Ｃ，ＧＵＯ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ。ｃｈａｒａｃｔｅｒ—　ｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＬＲＩＧ１［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　［１］　ＮＡＫＡＭＵＲＡ　Ｊ　Ｌ．Ｔｈｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００１，２８４（５）：１１５５—１１６１．　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｇｌｉｏｍａｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　［６］　ＬＪＵＳＬＩＮＤＥＲ　Ｉ，ＧＯＬ０ＶＬＥＶＡ　Ｉ，ＰＡＬＭＱＶＩＳＴ　Ｒ。ｅｔ　ａ１．　ＬＪ］．Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｔｈｅｒ　Ｔａｒｇｅｔｓ，２００７，ｌ１（４）：４６３—４７２．　ＬＲＩＧ１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ口］．Ａｃｔａ　Ｏｎｃｏｌ，２００７，　［２］　ＡＬＶＡＲＡＤＯ　Ｄ，ＲＩＣＥ　Ａ　Ｈ，ＤＵＦＦＹ　Ｊ　Ｂ．Ｂｉｐａｒｔｉｔｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉ０ｎ　４６（８）：１１ｌ８—１１２２．　ｏｆ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａ—　［７］　ＧＯＬＤ０ＮＩ　Ｓ，ＩＯＺＺ０　Ｒ　Ａ，ＫＡＹ　Ｐ．ｅｔ　ａ１．Ａ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｅｃｔｏｄｏ—　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｆ　Ｋｅｋｋｏｎｌ　ｒＪ＿．Ｇｅｎｅｔ—　ｍａｉｎ　ｏｆ　ＬＲＩＧ１　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｙ　ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ　ｂａｓａｌ　ｉｅｓ，２００４，１６７（１）：１８７－２０２．　ａｎｄ　ｌｉｇａｎｄ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＥＧＦＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，２６　［３］　ＬＡＥＤＥＲＩＣＨ　Ｍ　Ｂ，ＦＵＮＥＳＤＵＲＡＮ　Ｍ，ＹＥＮ　Ｌ．ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　（３）：３６８—３８１．　ｌｅｕｃｉｎｅ—ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬＲＩＧ１　ｉｓ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　［８］　ＧＵＲ　Ｇ，ＲＵＢＩＮ　Ｃ，ＫＡＴＺ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．ＬＲＩＧ１　ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ＥｒｂＢ　ｆａｍｉｌｙ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ。　ｆａｃｔｏｒ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｂｙ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｇ—　２００４，２７９（４５）：４７０５０—４７０５６．　ｒａｄａｔｉｏｎ　ＥＪ］．ＥＭＢ０　Ｊ，２００４，２３（１６）：３２７０—３２８１．　［４］　ＮＩＬＳＳＯＮ　Ｊ，ＳＴＡＲＥＦＥＬＤＴ　Ａ，ＨＥＮＲＩＫＳＳＯＮ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．　（２００８　０４—２４　收稿）　ＬＲＩＧ１　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ