nfkb的激活与检测方法

nfkb的激活与检测方法

生命活动中的一系列重要过程如细胞增殖、分化等是通过基因表达来实现的，这种基因表达控制首先通过特定转录因子在转录水平上进行。核转录因子(nuclear transcription factor)是一类蛋白质，它们具有和某些基因上启动子(promotor)区的固定核苷酸序列结合，而启动基因转录的功能。核转录因子kappa B(NF-κB)是其中重要的一组蛋白质，也是一类重要的转录激活因子，广泛存在于各种真核细胞中【1】。1986年，Sen 等【2】首次从鼠B淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，?称之为NF-κB。它们可以调节许多与免疫功能和炎症有关的基因，在机体生理和病理条件下，发挥重要的功能。现已表明NF-κB的功能涉及到免疫反应、胸腺发育、胚胎发生、炎症和急性反应、细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染等多种病理过程。

1. NF-KB的概述

1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及结构

在哺乳动物细胞中共有五种NF-κB家族成员【3】，它们是原癌基因C—Rel、NF—κB1(p50／p105)、NF—κB2(p52／p100)、Re1A(p65)、RelB。这些蛋白都有一个大约由300个氨基酸组成的氨基末端，称为Rel同源区(Rel homogeneous domain，RHD)或NRD(NF—κB／Rel／dorsa1)。其RHD内含DNA结合区，二聚体化区和核定位序列，分别具有与DNA -κB序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与

NF-κB抑制蛋白（IKB）家族成员相互作用并携带核定位信号（NLS），参与活化的NF-κB由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。

根据结构、功能和合成方式的不同，Rel蛋白分为两类。?一类为P50(?NF-?KB1）和P52(?NF-?KB2），?分别由含有C-末端锚蛋白重复序列（ahkrin ??repeat motif）的前体蛋白p105和p100通过ATP依赖蛋白水解过程裂解而形成。该类蛋白含有RHD，但缺乏转录活性区，无独立激活基因转录的功能。另一类为p65(RelA)，Rel（c-Rel),Rel B和果蝇的dorsal、Dif和Relish,它们没有前体，除N端的RHD外，?其C-端有一个或多个转录活性区，具有直接作用转录设备而激活基因转录的功能。除RelB外，其他成员在体外都可形成同二聚体或异二聚体，RelB只能形成由p50或p52组成的二聚体。

1.2NF-κB的抑制蛋白IκB和IKK

在没有刺激的细胞中，大部分的NF-κB二聚体通过与细胞质中三个抑制因子（IκBα、IκBβ、IκBε）中的一个结合而以无活性的状态存在【4】。目前研究发现IKBs共有7种结构类型，在哺乳动物中最重要的IκBs是IκBα、IκBβ、IκBε，且只有这3种IκB含有在外界信号刺激下被降解的N-末端调控区域【5】。它们共同的结构特征是在c端有一个特征性的锚蛋白重复序列。

IκBα影响并屏蔽位于RHD末端的核定位信号，研究证明，虽然不同的外界刺激通过作用于不同的IκB引起NF-κB有差别地活化【6】，但几乎所有已知NF-κB诱导物均能通过IκBα的降解迅速而短暂地活化NF-kB，同时IκBα不仅阻止已转移激活二聚体的DNA结

合，而且裂解他们同源DNA位点前体复合物。IκBβ和IκBε则起到缓冲系统活化波动趋势的作用，从而保持NF-κB有一个相对较长时间的响应。【5】

I-κB激酶IKK是I-κB离开NF-κB并使之得以活化的必需前提，随之降解抑制因子I-

κB。IKK是由一个调节亚单位，IKK-γ(也被称为NEMO)和两个催化亚单位IKK-α，IKKβ组成。IKKα和IKKβ属于丝/苏氨酸蛋白激酶，而NEMO虽包含有多个蛋白反应基序但却无明显的催化区。在经典的NF-KB激活途径中，IKKβ的活化起到了非常重要的作用。IKKβ基因敲除实验证实小鼠在缺乏IKKβ情况下，不仅影响

NF-κB激活通路，而且由于不能控制大量肝细胞凋亡而在胚胎期出现死亡，这些小鼠在炎症细胞因子作用时，NF-κB激活通路出现障碍，由此说明，IKKβ是促炎症反应因子刺激诱导NF-κB活化的主要激酶，IKKβ在NF-κB激活通路中可能比IKKα更重要【7】。

IKKα不只是传统的认为只是I-κB激酶，而且以其他的方式影响着基因的表达。DEVIN和YAMAM0TO等【8-9】研究认为IKKα可作用于IKKβ及其上游区而直接或问接增加IKKβ对IKBα的磷酸化作用，从而影响NF-KB基因的激活表达。Sankar ghosh和matthew s.hayden发现IKKα限制了促炎症巨噬细胞的反应【10】。

2．NF-κB的激活

细胞处于静息状态时，NF-κB-IκBs复合物(NF-κB-IκBα、NF-κB-IκBε)在胞浆与胞核之间穿梭，处于动态平衡。各种信号通过降解IκB s的方式来活化NF-κB，活化的NF-κB然后进入细胞核内

与DNA结合。IκB s首先是在IκB s激酶（IKK）催化下使其的32和36位丝氨酸残基磷酸化。接着IκB s在SCF-E3泛素化酶复合体的催化作用下多泛素化而被蛋白酶降解。活化的NF-κB转位到核内与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录。这种方式的NF-κB活化途径被称为经典的NF-κB活化途径。NF-κB通过该途径调节的目的基因有炎症介质、细胞因子(如TNF-α、IL-1等)、黏附分子、急性期蛋白及可诱导的效应期酶等。

其他的不被人所熟知的途径也能从IκB s中活化部分的NF-κB。这些途径包括酪氨酸磷酸化诱导的IκB s解离途径途径和蛋白激酶-2诱导的IκB s的流动加快的方式。释放后的NF-kB可以通过例如修饰自身的亚单位的方式来影响自身的转录激活效能。活化的NF-κB快速的诱导编码IκBα的基因的转录，因此产生高水平的自身抑制剂。新合成的自由的IκBα进入细胞核内，然后使DNA上NF-κB解离并且将NF-κB排出细胞核，因而恢复到静息状态。

3.生物学功能

3.1 NF-κ B与细胞凋亡

3.1.1抗凋亡的作用

最初，Beg等【11】在1995年发现缺乏RelA亚单位的鼠在胚胎期的死亡主要是因为肝细胞大量凋亡引起的提示含有RelA的NF-κB二聚体在胚肝中可以保护细胞不受促凋亡基因的影响：实验表明，缺乏NF-κB／Rel基因或含有NF-κB／Rel抑制剂的培养细胞在受到TNF或T细胞激活剂刺激时易发生凋亡【12】。