葡萄酿酒酵母研究进展

葡萄酿酒酵母研究进展　汤晓宏　，胡文效　（１．山东轻工业学院，济南２５０３５３；２．山东省酿酒葡萄科学研究所，济南２５０１００）　摘要：优良的葡萄酿酒酵母能使发酵过程易于控制，使葡萄浆果的优良品质在葡萄酒中得以最大限度的表达，　使葡萄酒香气协调、细腻、优雅，风格特征突出。本文对酵母的来源、主要筛选育种方法、鉴定手段及其与非酿酒酵　母结合的研究进展进行了综合阐述，为特色葡萄酿酒酵母的选育提供一定的参考依据。　关键词：葡萄酒；酵母菌；选育　葡萄酒的品质与风格特征，先天在原料，后天　在酿造。在葡萄酒的生产中，决定葡萄酒质量的因　葡萄园进行。　自然发酵醪中也含有丰富的酵母，且从发酵醪　素包括：葡萄原料品质、酿酒酵母的性能、酿造工　艺和生产设备四个方面。其中，在葡萄酒酿造中，　液中筛选酵母具有很强的针对性。酵母菌在发酵醪　中可以看作是经过了发酵醪微环境的初筛，具有了　对发酵环境的适应性，因此筛选的目的性更强［３］。　酿酒酵母的生理特性（菌体生长和代谢产物形成）　对酒的品质起决定性作用，是影响葡萄酒色泽、香　气、口感及风格特征的关键因素。优良的葡萄酿　酒酵母能使葡萄浆果的优良品质在葡萄酒中得到　最大限度的表达，代谢产物使得葡萄酒香气协调、　在酒精发酵过程中，不同酵母菌群在不同阶段存在　着群体的消长，但并不像“接力”一样，而是在种　群交替过程中存在着交叉。　除此之外，葡萄酒生产区、酿酒设备、储酒橡　木桶、酒窖等也是酵母的聚集地。凡与葡萄汁有过　细腻、优雅，风格特征突出，并使发酵过程易于控　制。因此，选育优良酵母菌种和优化工艺条件，探　索环境因素与微生物代谢活动之间的相互作用随时　间变化的规律是目前葡萄酒研究领域的热点之一。　１葡萄酿酒酵母的来源　酵母菌广泛存在于自然界中，有糖的地方就　可能存在酵母菌。凡是酵母栖息的地方都是分离筛　选酵母的取样地。成熟葡萄果实上常出现细小的裂　纹，果汁由此渗出，给酵母菌的生长和繁殖提供了　天然的条件。葡萄在秋季成熟后，容易从穗上脱落　下来，进入土壤，流出果汁，这个地方便会有大量　接触的厂区环境，包括运输工具、发酵罐、灌装设　备、生产车间和前处理设备等，甚至生产区的排水　通道、地沟以及葡萄酒皮渣堆积处都有大量的酵母　菌存在。因此，葡萄酒生产区也是一个很好的酿酒　酵母分离源。　２葡萄酿酒酵母的选育技术　２．１自然选育　自然选育即不经过人工后期加工处理，只利用　微生物自然突变进行菌种选育的过程。自然环境中　存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量　的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等，　的酵母菌繁殖，所以在葡萄园土壤中也存在着大量　的酵母菌，也可以说土壤是酵母菌的大本　”。在　传统的葡萄和葡萄酒产区，酵母菌多年繁殖生长，　都能引起菌种突变，使其具有某种较突出的特性。　战景娟等从山葡萄中分离出一株特殊的耐高　酸、耐低温酵母菌，该酵母经多次分离培养和发酵　逐渐适应了当地的气候条件、土壤条件和葡萄品　种，并且由于自然选择的作用而形成了适应于不同　类型葡萄酒的株系。但在新开辟的葡萄园或少量种　植葡萄的地区，土壤中的酵母菌数量不多，而且质　量也较差　Ｊ。因此对酵母菌的采集，常在比较老的　收稿日期：２０１２・０８—１４　指标检测，现已应用到山葡萄酒发酵中（即长白１　号酵母），发酵原酒具有独特的酒质风味【４］。李慧　等从“北红”葡萄汁自然发酵液中分离出天然葡萄　酒酵母，利用ＷＬ培养基对其进行鉴定，共分离获　作者简介：汤晓宏，山东轻＿Ｔ－，２ｋ学院研究生，生物化工专业。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉａｏｔａｎｇ１９＠１２６．ｃｏｒｎ　通讯作者：胡文效，山东省酿酒葡萄科学研究所研究员，山东轻工业学院生物化工专业硕士生导师。　２０１２．５　５３　得７种类型的葡萄酒酵母，其中一株具有典型的酿　酒酵母特征，利用模拟葡萄汁进行发酵试验，结果　显示分离菌种具有良好的乙醇转化能力，发酵速率　快、产甘油快，对高温、乙醇、渗透压、ｐＨ耐受　性好　】。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　Ａ．Ｌｏｐｅｓ等从葡萄汁样品中分离出　３２株酿酒酵母，分别对其发酵特性进行评价，最终　筛选出一株酿酒酵母菌株ＭＭｆ９，对其进行葡萄酒　发酵试验，显示菌株ＭＭｆ９性能优良，具有高发酵　力、产挥发酸低、泡沫少、硫化物少等优点　Ｊ。　由此看来，自然界中广泛存在着优良的葡萄酿　酒酵母野生菌株，通过对这些酵母菌进行分离和筛　选，就有可能获得优良的生产菌株，具有可观的经　济效益。　２．２原生质体融合育种　原生质体融合就是将两个亲本的细胞壁分别通　过酶解作用去除，使其在高渗环境中释放出只有原　生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲本的　原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（ＰＥＧ）　助融，使他们相互凝集，通过细胞质融合，两套基　因组之间经过接触、交换，从而发生基因组的遗传　重组，在再生细胞中获得重组体。　西北农林科技大学葡萄酒学院刘晓晴用Ｆ一２０—７　与酒类酒球菌ＳＤ一２ａ进行融合，获得的融合子降解　苹果酸的能力高达８５％，比已有报道的Ｆ一２０—７最高　降酸率高出７个百分点，与酒酒球菌的降酸能力不　相上下【　。　原生质体融合技术打破了微生物的种界界限，　可实现远缘菌株的基因重组，使遗传物质传递更为　完整、获得更多基因重组的机会。该方法可与其他　育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所　获得的优良性状组合到一个单株中。　２．３诱变育种　诱变育种是指利用物理、化学因素诱导动植物　的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人　们某种要求的个体，进而培育成新品种或种质的育　种方法。在酵母菌选育中一般采用紫外诱变，利用　紫外线照射菌株，加快其基因突变速率。　曹礼等对从葡萄表面筛选的野生酿酒酵母菌进　行紫外线诱变，培养后筛选出７株酿酒酵母菌的突　变株，通过测定菌株发酵性能、发酵液残糖含量以　及产酒精能力，最终筛选出１株残糖量少、酒精度　５４　２０１２。５　高、起酵速度快的酿酒酵母突变株＿８］。　但由于基因突变是不定向的，想要诱变出所希　望的性状完全靠偶然机会，过程繁琐，费时费力，　而且不一定能得到想要的结果。所以，该方法现在　很少单独使用，常与其它技术相结合。　２．４杂交育种　杂交育种是指不同种群、不同基因型的个体间　进行杂交，并在其杂种后代中通过选择而育成纯合　品种的方法。酵母菌的杂交主要通过有性杂交，利　用两种不同结合型的单倍体菌株或子囊孢子进行。　有的酵母如假丝酵母等不能进行有性繁殖，即不产　生子囊孢子，它们的杂交与霉菌一样，是通过准性　生殖进行的。　ＣＯＲＴＥ—ＲＥＡＬ　Ｍ等以能够将Ｌ．苹果酸作为唯　一碳源和能源的异常毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ａｎｏｍａｌａ）为　出发菌株，将抗葡萄糖阻碍的单倍体与相反结合型　的单倍体杂交，获得了能够在酒精发酵进行同时降　解苹果酸的双倍体酵母［９］。　杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作　为亲本，消除了菌株在经历长期诱变后所出现的产　量性状难以继续提高的障碍。因此不论在方向性还　是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步。但由　于杂交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难　像诱变育种那样得到普遍的推广和应用。　２．５分子生物学育种　分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结　构与功能，从而阐明生命现象本质的科学，如遗传　信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表　达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转　导等。随着科学的发展，在育种方面形成了克隆、　基因工程、代谢工程、进化工程等育种手段。　克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，　以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个　体组成的种群。夏双海等将裂殖酵母苹果酸通透　酶基因（ｍａｅ１）和苹果酸酶基因（ｍａｅ２）克隆到　酿酒酵母中，构建了苹果酸一酒精酵母，构建的酵　母重组子能够有效地分解发酵基质中的苹果酸　…。　Ｄｒａｎｇｉｒｉｓ　Ａ．Ｍ从Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ￣Ｓ．ｕｖａｒｕｍ品系中克隆　编码乙醇乙酰转移酶的基因，转导至酵母细胞中，　乙醇乙酰转移酶就表现出高活性，提高了啤酒中乙　酸异戊酯和乙酸乙酯等生香物质的生成，强化了啤　酒的香味¨　。　基因工程是把某一生物体的遗传物质片段克　隆或插入到葡萄酿酒酵母菌基因的特定位置中，实　现ＤＮＡ重组，使理想的外源ＤＮＡ片段在受体细胞　内得到表达，并稳定遗传而不改变受体原有特性　的一种技术。Ｃｏｕｌｏｎ　Ｊ等通过把ＤＵＲ１、２基因置于　ＰＧＫ１启动子的控制之下，获得了减少产生致癌物　的菌株¨　。　随之而发展起来的代谢工程也是通过基因工程　的方法改变细胞的代谢途径。利用代谢工程对酵母　的改造，首先要分析酵母细胞的代谢过程，寻求最　佳代谢途径，然后通过分子生物学技术进行基因操　作，改变基因结构、删除基因或导入一些新的基因　来改变酵母的代谢过程。目前利用代谢工程技术在　改变酵母菌种的底物利用、提高生产可操作性、控　制有害副产物产量及改善啤酒风味等方面取得了很　多进展　。　进化工程是一项全基因组水平的新兴技术，它　通过模拟自然进化中的变异和选择过程，实现对微　生物菌株优良性状的选育。近年来，进化工程在扩　大底物利用范围、提高代谢物产量及提高微生物耐　受性等方面取得了显著进展　。最近“进化工程”　或“定向进化”策略已被应用来改良实际生产中的　商业微生物菌株。　３葡萄酿酒酵母的分类、鉴定　３。１传统鉴定　传统酵母菌的分类鉴定主要采用形态学、生　理学及生物化学特征进行鉴定工作。一般要经过形　态观察，生理生化试验，再查索引表来确定所测菌　株的种属。需进行大量重复性试验，而且试验条件　稍有所变化就会影响试验的重现性，使结果难以确　定。加之大部分菌株的种类多、分类广、形态特征　简单，一些形态特征和生理生化指标甚至还会随环　境变化而不稳定，所以难以准确判断，常发生意见　分歧，引起分类系统的不稳定Ｉｌ　。随着生物技术的　飞速发展，传统的微生物鉴定方法常常难以鉴定众　多的生长习性复杂的微生物，因而基于基因组序列　的分子鉴定受到广泛关注。　３．２现代分子鉴定　分子分类学方法主要以核酸作为研究对象，研　究的是基因型，而不是表现型，因而能反映其遗传　本质。分子分类方法稳定性好，易确定同源关系，　便于计算机分析，因而提高了鉴定准确度，加快了　鉴定速度。近年来，随着分子生物学的发展而产生　了很多鉴定酵母菌的新方法＿１　：　（１）等位酶分析；　（２）ＤＮＡＧ＋Ｃ摩尔百分　含量分析；　（３）ＤＮＡ—ＤＮＡ杂交；　（４）染色体核　型分析；　（５）ＤＮＡ微卫星分析；　（６）巢式ＰＣＲ　（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）扩增；　（７）ＤＮＡ　的ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ）　分析；　（８）染色体ＤＮＡ的ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析；　（９）线粒　体ＤＮＡ的ＲＦＬＰ；　（１０）ｒＲＮＡ基因５．８Ｓ．ＩＴＳ区域的　ＰＣＲ－ＲＦＬＰ；（１１）ｒＤＮＡ序列分析；（１２）显微傅　里叶变换红外光谱分析；　（１　３）Ｔ－ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ—　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）；　（１　４）　酵母菌胞壁甘露聚糖核磁共振氢谱；　（１　５）可溶性　蛋白质凝胶电泳；　（１６）脉冲电泳核型分析。　白逢彦等　利用脉冲电泳核型分析对酿酒酵　母进行分类。研究表明，反映染色体条数和每条染　色体ＤＮＡ分子大小的脉冲电泳核型分析技术，可　作为酿酒酵母及相关菌种分类的辅助手段。染色体　组成多态性的存在虽然使脉冲电泳核型分析在种内　菌株间遗传差异的显示上具有一定的价值，但却影　响了其作为中间鉴别特征的直观性。因此，该技术　在分类学研究中的应用，应以形态、生理生化特性　等形状为基础。Ｅｗａ　Ｗ等分离了啤酒酿造中的１５株　酵母菌，通过ＡＰＩ３２Ｃ系统鉴定其中７株为Ｃａｎｄｉｄａ　ｓａｋｅ，利用微卫星引物Ｍ１３ＲＡＰＤ分析了Ｃａｎｄｉｄａ　ｓａｋｅ的多态性；与其它的Ｃａｎｄｉｄａ４（Ｎ比，这些菌株　的同源性比例为３７％，说明ＲＡＰＤ可用于比较种属　间的差　］。Ａｎｇｅｌａ　Ｘ等用２７种引物分析了葡萄酒　酵母菌种的多样性，分析了６株酒用酵母的微小差　异，确定它们的亲缘性从４０％～８０％不等，并且获　得每一种的特征图谱＿１　。李明霞等运用核磁共振氢　谱（ＰＭＲ谱）对各类酵母的胞壁甘露聚糖进行比较　研究，证明酵母胞壁多塘ＰＭＲｉ￣型相似程度的比较　是分类上较有意义的性状，有助于探讨亲缘关系，　核实完全型与不完全型也有助于对疑难菌株的分　析。　４葡萄酿酒酵母的研究概况　４．１特定优良性状酵母的研究　２０１２．５　５５　选育性能优良的葡萄酿酒酵母是酿制优质葡萄　酒的关键。将纯粹培养的葡萄酒酵母用于葡萄汁发　酵，对野生酵母和其它有害微生物均有抑制作用，　能保证发酵操作顺利进行，使发酵过程顺利而迅速　地完成。而且还可有效地提高葡萄酒产量和质量，　使制得的葡萄酒口味纯正，酒液清亮透明，成熟较　快，酒液与酵母容易分离。　隋玉洁等从来源不同的基质中分离得到１Ｏ０株　酵母菌，经初筛、复筛和酒精发酵试验，最终获得　一株耐酒精度１６％（Ｖ／Ｖ）酵母　】。祖显生等采　用苯酚硫酸法对１　２０株酿酒酵母属酵母进行了菌株　多糖产率的初步筛选，得到３株多糖产率高于工业　对照组菌株的酿酒酵母属酵母，并通过发酵试验对　其发酵性能进行测定，最终获得１株ＮＥ一１　８菌株符　合干白葡萄酒的生产要求　”。据资料显示：多糖特　别是甘露糖蛋白可以增加酒石和蛋白的稳定性，均　衡葡萄酒各组分、增加葡萄酒的圆润感和后味、增　加葡萄酒的香气复杂性、提高葡萄酒色素和单宁的　稳定性　。由于干白葡萄酒的蛋白稳定性比干红葡　萄酒的蛋白稳定性差，易产生沉淀，所以高产多糖　菌株对于干白葡萄酒酿造具有重要意义。Ｒａｉｎｉｅｒｉ　ｓ等人从Ｐａｒｍｅｓａｎ干酪乳清中筛选出的酿酒酵母　具有降低葡萄酒中苹果酸的作用，最高降幅可达　５０％ｒ　。　４．２产地酵母的研究　目前我国葡萄酒企业主要使用进口酵母，造　成酒的品种和风格比较单一，同质化现象严重；另　外，进口酵母与产地葡萄匹配度不高，不能充分显　示地域特色。所以选育具有区域特色的葡萄酿酒酵　母显得尤为重要，对我国葡萄酒的发展具有深刻意　义。　庞红勋等从天津地区采集的不同葡萄品种及　葡萄园土壤中，筛选出１６株葡萄酒酿酒酵母，并　对其特性进行研究，为进一步选育优良的本土葡萄　酿酒酵母提供材料和参考　。王慧以中国主要酿酒　葡萄产区（新疆、甘肃、陕西、宁夏、山东）的　葡萄果粒及压榨汁为分离源，对附生的天然酵母进　行了系统的收集和分离，并进行形态、生理生化及　２６ＳｒＤＮＡ　Ｄ１／Ｄ２序列鉴定，共鉴定出了１３个属２６个　种，丰富了我国的酵母基因资源库，对菌种工业和　食品发酵工业产品质量提高有实际意义。并在此基　５６　２０１２．５　础上，对已筛选的优良葡萄酒酵母及当地特定环境　条件下生产的优质葡萄原料进行了酿酒研究，比较　了不同酵母菌及配伍发酵对酒样理化指标、感官质　量及香气成分的影响，为优质产地葡萄酒的酿造提　供了参考　。刘爱国收集调查了宁夏葡萄产区的酿　酒酵母资源，分离获得宁夏贺兰山东麓葡萄酿酒酵　母菌分属于８个属１　０个种；银广夏三基地的葡萄酒　相关酵母菌分属于７个种；西夏王林葡萄园的葡萄　酒相关酵母菌分属于４个种；玉泉营农场葡萄园的　葡萄酒相关酵母菌分属于５个种，阐明了该地区酵　母菌种类、多样性和生态规律，建立了葡萄酒酵母　种质资源库，发掘具有中国产区特色的酵母菌种　质，为我国酿酒酵母菌的多样性研究、利用和优良　菌种的选育，为最终解决国产葡萄酒风味的同质　化，提高国际竞争力奠定了基础ｌ２　。　４．３与非酿酒酵母的结合　非酿酒酵母是一类自然存在于葡萄酒发酵中　的微生物，其代谢对葡萄酒的香气和风味等感官品　质有着重要影响。在一些传统产区，酿酒师往往会　综合考虑地理位置、气候条件、葡萄品种、栽培情　况、酿造工艺条件、卫生状况等因素，在适宜条件　下进行葡萄汁自然发酵，充分利用非酿酒酵母的优　点及其与酿酒酵母间有益的相互作用，酿造出风味　复杂、风格独特的葡萄酒。　目前，对非酿酒酵母的研究已引起业内人士　的极大关注。ＫＡＰＳＯＰＯＵＬＯＵ　Ｋ等利用耐热克鲁　维酵母和酿酒酵母混合发酵，实现了生物降酸口　。　ＴＯＲＯ　ＭＥ等利用Ｃａｎｄｉｄａ　ｖａｌｂｙｅｎｓｉｓ￣Ｎ酿酒酵母混　合顺序发酵，有效地控制了发酵行为，与纯种酿酒　酵母发酵的葡萄酒相比，在羟基丙酮、丙醇、琥珀　酸、甘油等成分含量上有较大差异，所酿出的酒特　色更加突出　。ＳＯＤＥＮ　Ａ等利用星形假丝酵母和　酿酒酵母混合发酵，对霞多丽葡萄酒的香气形成进　行研究，结果表明其香气是由混合发酵产生的，而　且星形假丝酵母自身产香气和高产甘油的能力，只　有当顺序接种（即先接星形假丝酵母，间隔一定时　间后再接酿酒酵母）时才能体现出来　…。　５展望　葡萄酒酵母的选育是科学性、实践性很强的工　作，是一项复杂的系统工程。目前国内虽然有不少　科研人员对各地葡萄酒产区酵母进行研究，但其研　究主要集中在对酵母的分类鉴定及酿造性能的测试　阶段，对酵母的研究还不够系统、深入，很少有正　式投入生产使用的，整体水平较国际先进水平存在　较大差距。　对我国不同葡萄酒产区特色酵母菌的选育与葡　萄酒发酵动力方面的研究，是我国葡萄酒产业自主　创新的重要方向。这一工作的深入、广泛开展和对　现研究水平的突破，对于突出产区葡萄酒产品风格　特点、增强产品市场竞争力具有关键作用，是我国　葡萄酒产业发展的客观要求，对提高我国葡萄酒产　业综合竞争力具有重大意义。　参考文献　［１］［德］赫尔姆特，汉斯，迪特里希．葡萄酒微生物学［Ｍ］．轻工业　出版社．１９８９．　［２】李华．现代葡萄酒工艺学［Ｍ］．陕西：陕西人民出版社，２００３．　［３］Ｌ．Ｂ．Ｍ．Ｔｉｊｂｕｒｇ，Ｔ．Ｍａｔｔｅｒｎ．Ｄ．Ｆｏｌｔｓ，ｅｔ　ａ１．Ｔｅａ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｅｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｃｒｉｔｒｅｖｓ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ　Ｎｕｔｒ．１９９７，　３７ｆ８１：７７１—７７８．　［４］战景娟，金永键．山葡萄选育酵母的应用［Ｊ１．酿酒，２００４，２，　８０—８１．　【５］李慧，王惠玲，吴雅琨，等．天然葡萄酒酵母菌种的分离、鉴定　和酿造性能评价［Ｊ］．食品与发酵工业，２０１０，３６，ｌ１（２７５）：１４—２７．　［６］Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　Ａ．Ｌｏｐｅｓ，Ｍａｒｉａ　Ｅ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍａｒｃｅｌａ　Ｓａｎｇｏｒｒｉｎ，ｅｔ　ａ１．Ｐａｔａｇｏｎｉａｎ　ｗｉｎｅｓ＂ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ　ｙｅａｓｔ　ｓｔａｒｔｅｒ［Ｊ］．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００８．０８：５３９—　５４６．　［７］刘晓晴．降酸葡萄酒酵母选育研究［Ｄ］．陕西：中国优秀硕士　学位论文全文数据库（西北农林科技大学），２００６．　［８】曹礼，王晓琴，李彩霞，等．酿酒酵母菌的紫外诱变及其突变株　的性能测定［Ｊ］．中国酿造，２００９，１０：６６—６８．　【９］ＣＯＲＴＥ—ＲＥＡＬ　Ｍ，ＬＥＡＯ　Ｃ．Ｄｅａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒａｐｅ　ｊｕｉｃｅ　ｗｉｔｈ　ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｅｄ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ａｎｏｍａｌａ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔ，ｌ　９９２，３６：６６３—６６６．　［１０】夏双海，刘树文，张春晖，等．Ｌ一苹果酸降解相关基因在酿酒　酵母中的表达［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００３（２）：４７—５３．　［１１］Ｄｒａｎｇｉｒｉｓ，Ａ．Ｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＴＡ１　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ＭＡＴ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌｉｆｅ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　１９８９，９（９）：３９９２—３９９８．　［１２］Ｃｏｕ　Ｊ，Ｈｕｓｉｎｋ　ＪＩ，Ｉｎｇｌｉｓ　ＤＬ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｔｏ　ｍｉｎｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｔｈｙｌ　ｃａｒｂａｍａｔｅ　ｉｎ　ｗｉｎｅ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｅｎｏｌ　Ｖｉｔｉｃ，２００６，５７（２）：１１３—１２４．　［１３］张强，王加宁，迟建国．啤酒酵母代谢工程研究进展『Ｊ１．中国　生物工程．２００９，２９（１２１：１　１９．１２４．　［１４］巩继贤，郑辉杰，郑宗宝，等．微生物进化工程育种技术进展　与展望［ＪＪ＿生物加工过程，２０１０，８（２）：６９—７６．　［１５］白逢彦，梁慧燕，贾建华．假丝酵母属疑难菌株大亚基ｒＤＮＡ　Ｄ１／Ｄ２区域序列分析及其分类学意义［ＪＪ．菌物系统，２００２，２１（１）：　２７—３２．　【１６］程雷．葡萄自然发酵过程中酵母的分离鉴定及优良葡萄酒酵　母筛选［Ｄ］．黑龙江：中国优秀硕士学位论文全文数据库（东北　林业大学），２０１０．　［１７］白逢彦，贾建华．脉冲电泳核型分析在酿酒酵母菌分类学研　究中的应用［Ｊ］．微生物学报，２０００，１９（２）：９－１１．　【１　８］Ｅｗａ　ｗ，Ａｎｎａ　Ｃ，Ｗｏｊｃｉｅｃｈ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．ＲＡＰＤ　ｗｉｔｈ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ａｓ　ａ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｅｎｕｓ　ｙｅａｓｔｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｂｒｅｗｉｎｇ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，３：３０５—３１２．　［１　９］Ａｎｇｅｌａ　Ｘ，Ｆｅｒｎａｎｄａ　Ｓ．Ｕｓｅ　ｏｆ　ＲＡＰＤ　Ａｎａｌｙｓｉ　Ｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｍｏｎｇ　Ｓｉｘ　Ｅｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．　Ｆｏｏｄ　ｔｅｃｈｎｏｌ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，３８（１）：５３—５８．　［２０］隋玉洁，李伟林．一株耐酒精酵母菌的选育研究［Ｊ］．酿酒，　２００１，４，３８：３９—４１．　［２１］祖显生，刘树文，何玲，等．高产多糖干白葡萄酒酵母的初步　筛选及其发酵特性研究［Ｊ］．酿酒科技，２００７，１２（１６２）：３６—３９．　［２２１朱力，王显苏，Ｄ．ＧＵＥＲＲＡＮＤ，等．酵母多糖有效改善葡萄酒　的整体１：３感和品质【Ｊ】．中外葡萄与葡萄酒，２００５，３：６０—６３．　［２３］Ｒａｉｎｉｅｒｉ　Ｓ，Ｚａｍｂｏｎｅｌｌｉ　Ｃ，Ｐａｓｓａｒｅｌｌｉ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｉｔｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ　ｓｔａｉｎｓ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｅｎｓｕ　ｓｔｒｉｃｔｏ［Ｊ］．Ｉｎｄ．Ｂｅｖａｎｄｅ，１９９６，２５：５６５—５７０．　［２４］庞红勋，崔艳，刘金福，等．本土葡萄酒酵母的选育及发酵性　能【Ｊｊ．食品研究与开发，２０１０，６，３１：１６９　１７４．　【２５］王慧．中国主要产地葡萄酒酵母菌种构成研究【Ｄ］．山东：中　国优秀硕士学位论文全文数据库（山东轻工业学院），２００８．　［２６］￣Ｊ爱国．宁夏贺兰山山麓葡萄酿酒酵母菌的分离及其分类鉴　定［Ｄ］．陕西：中国优秀硕士学位论文全文数据库（西北农林科　技大学），２００８．　［２７］ＫＡＰＳＯＰＯＵＬＯＵ　Ｋ，ＭＯＵＲＴＺＩＮＩ　Ａ，ＡＮＴＨＯＵＬＡＳ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｉｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｇｒａｐｅ　ｍｕｓｔ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｍｉｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．ＪＡｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００８，１０４（４）：１０５１－１０５８．　［２８］ＴＯＰＯ　ＭＥ，ＶＡＺＱＵＥＺ　Ｆ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｍｉｘｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔｓ［Ｊ］．Ｊ　ｌｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔ，　２００６，３３（３）：１９２—１９６．　［２９］ＳＯＤＥＮ　Ａ，ＦＲＡＮＣＩＳ　ＩＬ，ＯＡＫＥＹ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＯ—　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｔｅｌｌａｔａ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｒｏｍａ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ　ｗｉｎｅ［Ｊ］．Ａｕｓｔ　Ｊ　Ｇｒａｐｅ　Ｗｉｎｅ　Ｒｅｓ，２０００．６：２１—３Ｏ．　２０１２．５　５７