(完整版)LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤

24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤： (在生长培养基中直接加入复合物)

1。转染前一天，胰酶消化细胞并计数,将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90％.细胞铺板在0。5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞,使用50μl OPTI—MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000,室温温浴5分钟

（在5-25分钟内同稀释的DNA混合.保温时间过长会降低活性。可以批量制备。） 注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI—MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养. 3。对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI—MEMⅠ培养基)稀释0。8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。

4。混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000(由第2步).在室温保温20分钟。 注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定.

5。直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板,轻轻混匀. 注意：如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。

6.在37℃，5％的CO2中保温18—48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4—5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

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7.在细胞中加入复合物18—72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性.对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1:10），两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周.