丁基苯酞对局灶型脑缺血再灌大鼠脑hsp70mRNA和c_fos时相表达的影响

丁基苯酞对局灶型脑缺血再灌大鼠脑hsp70mRNA和

c2fos时相表达的影响

熊　杰　冯亦璞

(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所,北京100050)

摘要　用原位杂交法和Northern印迹法,研究NBP对暂时性大脑中动脉阻断大鼠不同再灌期脑内hsp70mRNA和c2fos的时相表达的影响。发现缺血后再灌1h,在缺血侧有较明显的hsp70mRNA表达。

再灌3h,6h和12h,表达逐渐加强。在缺血前10min和再灌即刻ipNBP10mg・kg-1和20mg・kg-1均能明显降低再灌6h和12hhsp70mRNA的表达。c2fos基因在再灌015h在缺血侧有清晰表达,再灌3h达峰值,再灌6h表达降低。ipNBP10mg・kg-1(缺血前10min)可明显降低再灌1h和3h时c2fos的表达。Northern印迹法显示了同样的结果。提示NBP降低基因表达的作用可能是通过减轻缺血再灌引起的组织损伤来实现的。

关键词　丁基苯酞;暂时性大脑中动脉阻断;基因表达;热休克蛋白;立即早期基因;原位杂交;

Northern印迹法

　　大鼠局灶型脑缺血再灌引起的继发性损伤,引起了脑内许多基因表达的变化[1],其中

热休克蛋白(hsp)70mRNA的表达与缺血性脑损伤密切相关[2],该基因在生理状态下无表达,而只在有害刺激如热、毒物、癫痫和脑缺血等应激下才出现表达,并在一定程度内随损伤的加深而加强[3],其表达产物HSP70蛋白分子,可以调节其他一些蛋白的折叠,装配及在细胞内的运输,发挥细胞内防御功能[4]。立即早期基因c2fos是缺血早期表达基因之一,其表达蛋白与另一类立即早期基因jun的表达蛋白结合成杂二聚体,作用于靶基因启动子的特殊位点,调节与缺血迟发性反应有关的基因的表达[5]。正丁基苯酞(dl232n2butylphthalide,NBP)是源于天然的合成消旋体,药理学实验表

肿[8],提高缺血区局部脑血流[9]等。为探讨NBP脑保护作用机制,本文用原位杂交和Northern印迹法观察了NBP对局灶型脑缺血再灌大鼠脑内hsp70mRNA和c2fos表达的影响。

材料与方法

明它有良好的抗脑缺血作用,如提高缺血大鼠脑内ATP和磷酸肌酸水平[6],降低缺血引起的脑梗塞面积并改善神经功能[7],减轻脑水

本文于1997年7月18日收到。

本研究为国家科委1035工程基金(9422D201)资助

药品与试剂　NBP为本所合成室提供,纯度>96%,用Tween80制成10mg・ml-1混悬液。DIGDNALabelingandDetectionKit,购于BoehringerMannheim公司。ProteinaseK,购于E.Merck公司。c2fos探针由Sigma公司获得。本所张均田教授赠予质粒上整合有213Kb人hsp70cDNA的细菌,本实验室进行扩增和提纯。

局灶型缺血再灌模型　体重300～350g♂Wistar大鼠56只,购自中国医学科学院实验动物繁殖中心。缺血再灌模型根据文献[10]制作。动物水合氯醛(360mg・kg-1,ip)麻醉后,沿颈正中切开,仔细分离左侧颈内颈外动

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脉,将一根长510cm、直径0126mm的圆头硅

化尼龙线,由颈外动脉插入颈内动脉约210cm,直至颅内段大脑中动脉口处,缺血1h后小心抽出尼龙线,缝合伤口后放回原笼,hsp70组分别再灌1h,3h,6h,12h;c2fos组分别再灌015h,1h,3h,6h。全部过程保持室温24～25℃。假手术对照组除硅化尼龙线不插入外,其他操作均与缺血再灌组相同。

给药方式　缺血前10minipNBP10mg・kg-1,或缺血后即时ipNBP20mg・kg-1;假手术对照组给予相应体积溶剂。

探针制备与标记　将质粒上整合有人hsp70cDNA片断的细菌增殖,按碱裂解法[11]提取质粒DNA后以EcoR.I和BamH.I进行酶切,酶切液在110%琼脂糖凝胶上电泳分离并以电泳洗脱法回收长度为119Kb的条带,即为hsp70cDNA片断。将此片断和购得的c2fos探针(113Kb)按地高辛试剂盒要求进行标记和纯化。

原位杂交　缺血再灌动物以水合氯醛麻醉,切开颈静脉,立即左心室内灌注生理盐水和4%多聚甲醛(新鲜PBS配制)固定液各50ml,断头取出完整大脑,常规固定。固定好的组织块于-18℃行20μm冠状切片。杂交时先将切片复水,PBS轻洗后于新配制的1μg・ml-1蛋白酶K(50mmol・L-1EDTA,011mol・L-1Tris・HCl,pH810)中37℃消化30min,水洗,再于011mol・L-1三乙醇胺(pH810)中彻底搅拌,同时在每100ml该溶液中加入乙酸酐015ml,待其完全溶化后静置10min使切片乙酰化,之后以2×SSC(013mol・L-1NaCl,0103mol・L-1柠檬酸钠,pH710)洗净,乙醇脱水,空气干燥。以标准杂交液68℃避光预杂交2h后滴加变性的地高辛标记cDNA探针100μl/片(1ng・μl-1),加盖片杂交14h后按试剂盒要求洗片,封闭,进行地高辛标记的抗原抗体反应和显色反应。

Northern印迹法　根据原位杂交的结果,

选择各基因表达最高的再灌时间点,即hsp70

组再灌12h,c2fos组再灌3h的各组动物,断头后迅速取出完整缺血侧(左侧)大脑半球,按热酚法[12]提取组织总RNA,分别于112%(c2fos)和018%(hsp70)甲醛变性凝胶上进行电泳,在302nm处观察到清晰明亮的18s,28srRNA条带后,以硝酸纤维素膜转膜6h,80℃烤膜2h固定RNA条带,再将膜封入标准杂交液中,68℃预杂交2h,取出膜封入含标记探针的杂交液中,继续杂交14h。杂交完毕后将膜取出,按试剂盒要求轻洗,封闭,进行地高辛标记的抗原抗体反应和显色反应。

结果

1　NBP对局灶性缺血再灌大鼠脑hsp70mRNA表达的影响

由图1可见,假手术组未见hsp70mRNA表达,而缺血(1h)再灌侧有明显的表达,随再灌时间的延长,表达逐渐加强。具体表现为在再灌1h,缺血侧海马区和纹状体出现清晰的hsp70mRNA表达;再灌3h表达显著增加,再灌6h时表达主要集中在纹状体外侧和皮层内侧;再灌12h表达部位在皮层。缺血侧这一时相表达与文献报道[3]基本一致。在再灌1h,3h非缺血侧(健侧)亦可见轻度的hsp70mRNA表达,推测可能是由于缺血早期健侧组织的应激反应所引起的。缺血前10minipdl2NBP10mg・kg-1可以显著降低再灌6h和12h时hsp70mRNA在皮层和海马区的表达,其中再灌6h缺血侧无可见表达,再灌12h纹状体还可见轻度表达;缺血后即刻ipdl2NBP20mg・kg-1同样可以降低再灌6h和12h时hsp70mRNA在皮层和海马区的表达。用Northern印迹法,缺血前10minipdl2NBP10mg・kg-1和缺血后即刻ip20mg・kg-1同样可以降低再灌12h时hsp70mRNA的表达(图3)。

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Fig1　Expressionofhsp70mRNAinratbrainintherecoveryprocessfollowing1hMCAocclusioncausedbyintraluminalthread.Sectionswere20μm,hybridizedwithDig2labeledcDNA.a:Sham;b

→e:Vehicle,reperfusiontimewas1h,3h,6hand12h,respectively;f→g:NBP10mg・kg-1,10

minbeforeischemia(ip),reperfusiontimewas6hand12h;h→i:NBP20mg・kg-1,justafterischemia(ip),reperfusiontimewas6hand12h.2　NBP对局灶性缺血再灌大鼠脑c2fos表达

达,可能与组织量少造成的信息量低有关。

的影响

由图2可见,假手术组c2fos基因基本无表达,缺血再灌可以引起明显的c2fos表达。在再灌015h出现在缺血侧皮层,3h达峰值,而在6h显著降低,与文献报道[4]一致。NBP预防给药(缺血前10minip10mg・kg-1)可明显降低再灌1h,3h时c2fos的表达。Northern印迹法同样显示出缺血前10minipNBP10mg・kg-1能降低再灌3h时c2fos的表达(图3)。在Northern印迹法结果中还可见到假手术组有少量的c2fos表达,这可能是由于手术等原因造成,而原位杂交中假手术组未见这一表

讨论

立即早期基因c2fos在脑缺血损伤反应中扮演着重要角色,随着脑缺血引起损伤程度的加强,c2fos的表达亦逐渐加强;给予神经保护性药物如NMDA受体拮抗剂dizocilpine[13],MK2801[14]等后就会降低由脑缺血引起的c2fosmRNA表达的增强。在本实验中,NBP预防给药能明显降低再灌后增强的c2fos表达,结果与上述报道一致,说明NBP可以通过减少缺血再灌时损伤性基因c2fos的表达而发挥其脑保护作用。

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　　hsp70mRNA在脑缺血损伤时的表达被认

为有神经保护作用,它主要起伴侣蛋白(chapteron)的作用,使某些受损蛋白重新折叠,以恢复其功能,因此是机体的自身防御功能的重要组成部分[15]。在损伤细胞中,hsp70mRNA的表达,在一定范围内随损伤程度的加强而增强,其表达区域与缺血易损区(CA1区)较一致,而表达时相则与梗死面积时相较一致[16],是脑缺血损伤后细胞可能存活的一个重要标志,对维持损伤区蛋白质的稳定和功能有重要意义。已有文献表明,抗脑缺血作用的药物如阿片κ受体激动剂enadoline[13],NMDA受体非竟争性拮抗剂MK2801[17,18]和dizocilpine[13]等,可以降低缺血引起的hsp70mRNA表达的升高。Enadoline可能是作用于突触前κ受体,使谷氨酸释放减少,从而发挥其脑保护作用。MK2801和dizocilpine则作用于NMDA受体,减少外Ca2+内流,它们的抗脑缺血机制各有不同,但都能使hsp70mRNA的表达降低至正常水平,作者认为它们对hsp70基因的作用可能是继发性的。在我们的实验中,

Fig3　Northernblotofhsp70mRNAandc2fosinratbrainat12h(hsp70mRNA)and3h(c2fos)ofrecoveryrespectivelyfollowing1h2MCAocclusioncausedbyintraluminalthread.mRNAswerehybridizedwithDig2labeledcNDA.a:Control;b:Vehicle;c:NBP10mg・kg-1(ip),10minbeforeischemia;d:NBP20mg・kg-1(ip),justafterischemia.

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NBP无论预防给药还是治疗(缺血即时)给药

均能明显降低缺血引起的hsp70mRNA表达

增高。因NBP有良好的抗脑缺血和脑保护作用,NBP降低hsp70mRNA表达的作用可能也是通过改善缺血脑内的能量代谢(待发表),减轻了缺血引起的组织损伤和继发性损伤反应,使缺血损伤诱导的hsp70mRNA的表达降低。

致谢　本组王春华同志参与了hsp70cDNA的提取和地高辛标记工作,周兰芳教授在组织切片制备中给予很大帮助。

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・406・药学学报ActaPharmaceuticaSinica1998,33(6)∶401～406

EFFECTOFDL232N2BUTYLPHTHALIDEONTHEEXPRESSIONOF

HSP70mRNAANDC2FOSINTRANSIENTCEREBRALISCHEMIC

ANDREPERFUSEDRATBRAIN

XiongJie(XiongJ)andFengYipu(FengYP)

(InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050)

ABSTRACT　Transientcerebralischemiamaycausestrikingchangesingeneexpressioninratbrain.Theinductionofheatshockprotein70(hsp70)mRNAisconsideredtobeanimportantmarkerofcerebralischemiainjury,andc2fosmayupregulatetheexpressionofothergenesrelatedtothesecondaryinjuries.dl232n2Butylphthaline(NBP)hadbeenshowntohavegoodanti2cerebralischemiceffect.UsingtheinsituhybridizationandNorthernblottechnique,theeffectofNBPontheexpressionofhsp70mRNAandc2fosintransientmiddlecerebralarteryocclusion(MCAo)ratcausedbyintraluminalthreadwasstudied,andfoundthattheexpressionofhsp70mRNAwasatthelesionedsiteat1hofreperfusion.Itincreasedgraduallywiththedurationofreperfusiontimeandpeakedat12hatthelesionedsite.WithNBPtreatment(ip10mg・kg-110minbeforeischemiaor20mg・kg-1afterischemia),theexpressionofhsp70mRNAattenuatedsignificantly.Forc2fos,theexpressionappearedat015hofreperfusion,peakedat3h,anddecreasedat6h.NBPpretreatment(10mg・kg-110minbeforeischemia)alsodecreasedthec2fosexpression.ThesameresultswereobtainedwithNorthernblottechnique.SinceNBPhadbeenshowntohavegoodanti2cerebralischemiceffects,theattenuatingeffectongeneexpressionseemedtobethesecondaryeffectafterthealleviationoftissueinjury.

KEYWORDS　dl232n2Butylphthalide;Transientmiddlecerebralarteryocclusion;Geneexpression;hsp70mRNA;c2fos;Insituhybridization;Northernblot