高效液相色谱法测定穿虎痛风合剂中大黄素含量

２０１２年８月５日第２ｌ卷第ｌ５期　Ｃｈｉｎａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　中目茄　・药物鉴定・　Ｄｒｕｇ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　高效液相色谱法测定穿虎痛风合剂中大黄素含量　王景禄，杨晓，张春辉，吴爱英　（山东省青岛市药品检验所，山东青岛　２６６０７１）　摘要：目的建立测定穿虎痛风合剂中大黄素含量的高效液相色谱法。方法采用Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　Ｃｌ８柱（２５０　ｍｍ　ｘ　４．６　ｍｍ，５　ｐ．ｍ），以甲　醇一０．１％磷酸溶液（８０：２０）为流动相，柱温为３５℃，流速为１．０　ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２５４　ｎｍ。结果大黄素进样量在５．７４２～８６．１３　ｇ　范围内与峰面积呈良好线性关系（ｒ＝０．９９９　９），平均加样回收率为９８．９５％，ＲＳＤ：０．９９％（ｎ＝９）。结论所建立的方法简便可靠、分离　度好，可用于穿虎痛风合剂的质量控制。　关键词：高效液相色谱法；大黄素；穿虎痛风合剂；质量控制　中图分类号：Ｒ２８４．１；Ｒ２８６．０　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—４９３１（２０１２）１５—００５５—０２　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｍｏｄｉｎ　ｉｎ　Ｃｈｕａｎｈｕ　Ｔｏｎｇｆｅｎｇ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　Ｗａｎｇ　Ｊｉｎｌｕ，　Ｘｉａｏ，Ｚｈａｎｇ　Ｃｈｕｎｈｕｉ，Ｗｕ　Ａｉｙｉｎｇ　ｒ　Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｑｉｎｇｄａｏ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ　２６６０７１　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｏｄｉｎ　ｉｎ　Ｃｈｕａｎｈｕ　Ｔｏｎｇｆｅｎｇ　Ｍｉｘｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　Ｃ１８　ｃｏｌｕｍｎ（２５０　ｍｍ　ｘ４．６　ｍｍ，５　Ｉｘｍ）．Ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｗａｓ　ｍｅｔｈａｎｏｌ一０．１％Ｈ３Ｐ０４（８０：２０）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｌｏＷ　ｒａｔｅ　ｏｆ　１．０　ｍＬ／ｍｉｆｎ；Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｗａｓ　２５４　ｎｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　３５　ｏＣ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｕｎｄｅｒ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．０８６　１　３—０．４３０　６　Ｉｘｇ　ｆｏｒ　ｅｍｏｄｉｎ　ｓａｍｐｌｅ　ｓｉｚｅ　（ｒ＝０．９９９　９）．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　９８．９５％，ＲＳＤ＝０．９９％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｃｈｕａｎｈｕ　Ｔｏｎｇｆｅｎｇ　Ｍｉｘｔｕｒｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ；ｅｍｏｄｉｎ；Ｃｈｕａｎｈｕ　Ｔｏｎｇｆｅｎｇ　Ｍｉｘｔｕｒｅ；ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｌ　穿虎痛风合剂是由虎杖、忍冬藤、穿山龙等９味中药制成的　材，按供试品制备工艺和供试品溶液制备方法，制成阴性对照品　溶液。　２．３方法学考察　复方制剂，具有祛风除湿、活血化瘀、通络止痛的功能，用于痛风　性关节炎的急性发作。笔者建立了测定穿虎痛风合剂中大黄素含　量的高效液相色谱法，方法准确、简便，灵敏度高，现报道如下。　１　仪器与试药　线性关系考察：分别精密吸取对照品溶液１，３，５，７，１０，１５　，　注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积ｙ对质量浓度Ｘ（￣ｇ／ｍＬ）　作线性回归，得线性回归方程Ｙ＝１５．１４１　１１６　５Ｘ＋２．２６９　７０１　６，　ｒ＝０．９９９　９（ｎ＝６）。结果表明，大黄素进样量在５．７４２～８６．１３　ｔｘｇ　范围内与峰面积呈良好线性关系。　Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）。大　黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为１１０７５６—　２００１１０）；穿虎痛风合剂（青岛大学医学院附属医院）；甲醇为色谱　纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。　２　方法与结果　精密度试验：精密吸取同一对照品溶液５　，连续进样６次。　结果的ＲＳＤ为０．０４％（ｎ＝６），表明仪器精密度良好。　稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，按拟订的色谱条件，　分别于０，１，２，４，６，８，１０，１５，２０　ｈ时进行测定。结果的ＲＳＤ为　０．１６％（ｎ＝９），表明该方法下供试品溶液在２０　ｈ内稳定。　２．１　色谱条件与系统适用性试验　色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　Ｃ１８柱（２５０　ｍｍ×４．６　ｍｍ，５　ｍ）；柱温：　３５℃；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；流动相：甲醇一０．１％磷酸溶液（ｓｏ：２０）；　检测波长：２５４　ｎｍ；进样量：５　ＩｘＬ。理论板数按大黄素峰计算应不　低于３　０００　，色谱图见图１。　重复性试验：取同一批样品６份，依法制备供试品溶液并测　定含量。结果平均含量为０．０５４　９　ｇ／Ｌ，ＲＳＤ＝０．８０％（ｎ＝６），表　明此方法重复性较好。　加样回收试验：精密称取经五氧化二磷减压干燥１２　ｈ后的　０　８　０　８　ｌ６　ｉＬ一　Ｃ　大黄素对照品适量，）Ｊｎ－－氯甲烷溶解制成质量浓度为０．１０９　８　ｇ／Ｌ　的贮备液备用。分别吸取该贮备液１５，１０，５　ｍＬ至１００ｍＬ量瓶，　Ａ　Ｂ　Ａ．对照品溶液　Ｂ．供试品溶液　图１　高效液相色谱图　２．２　溶液制备　精密称取经五氧化二磷减压干燥１２　ｈ的大黄素对照品适　量，加甲醇制成质量浓度为２８．７１　ｐ￣ｇ／ｍＬ的对照品溶液。精密吸　取样品１０　ｍＬ，精密加入二氯甲烷２５　ｍＬ和稀盐酸溶液１５　ｍＬ，称定　质量，置水浴中加热回流２　ｈ，冷却至室温，再称定质量，用二氯　甲烷补足减失的质量，摇匀，分取二氯甲烷液，精密量取１０　ｍＬ，　蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至５　ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至刻　度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。按处方比例取除虎杖的其余药　・药物鉴定・　Ｄｒｕｇ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　中Ｉ　茄　Ｃｈｉｎａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　２０１２年８月５日第２１卷第ｌ５期　Ｖｏ１．２１，Ｎｏ．１５，Ａｕｇｕｓｔ　５，２０１２　高效液相色谱法测定苯佐卡因软膏中苯佐卡因含量　杨丽杰，牟阳，王金华，胡宝荣，张婧　（哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江哈尔滨　１５０００１）　摘要：目的建立测定苯佐卡因软膏中苯佐卡因含量的高效液相色谱法。方法色谱柱为ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ　ＯＤＳ—ＢＰ柱（２５０　ｍｍ　ｘ　４．６　ｍｍ，　５　ｍ），流动相为甲醇一水一冰醋酸（８０：２０：０．５），流速为１．０　ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２９１　ｎｍ。结果线性回归方程为Ｙ：１．１９　ｘ　１０６Ｘ一　２．７５×１０　，ｒ＝０．９９９　８８６；苯佐卡因质量浓度在２．５０—４０．００　ｐ￣ｇ／ｍＬ范围内与峰面积线性关系良好；平均加样回收率为９９．２８％，ＲＳＤ　为０．７３％（／２＝６）。结论该法操作简便，结果准确可靠，可用于测定苯佐卡因软膏中苯佐卡因的含量。　关键词：高效液相色谱法；苯佐卡因软膏；苯佐卡因；含量测定　中图分类号：Ｒ９２７．２；Ｒ９７１　．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—４９３１（２０１２）１５—００５６—０２　ＨＰＬＣ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　Ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ　Ｏｉｎｔｍｅｎｔ　昭Ｌｉｊｉｅ，Ｍｕ　，Ｗａｎｇ　Ｊｉｎｈｕａ，Ｈｕ　Ｂａｏｒｏｎｇ，Ｚｈａｎｇ　Ｊｉｎｇ　ｆ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｆｉｌｉｆａｔｅｄ　Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｅｒｂｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｅｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｆｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ　１５０００１　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　Ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ　Ｏｉｎｔｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｃｈｒｏ—　ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｃｏｌｕｍｎ：ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ　ＯＤＳ—ＢＰ　ｃｏｌｕｍｎ（２５０　ｍｍ　ｘ　４．６　ｍｍ，５　Ｉｘｍ）．Ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｗａｓ　ｍｅｔｈａｎｏｌ—ｗａｔｅｒ—ｇｌａｃｉａｌ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　（８０：２０：０．５）．Ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ：１．０　ｍＬ／ｍｉｎ．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｗａｓ　２９１　ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｙ＝１．１９×１０　Ｘ一　２．７５　ｘ　１　０５。ｒ＝０．９９９　８８６．Ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　２．５０—４０．００￣ｇ／ｍＬ　ｗｉｔｈ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅＴｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ａｖ—　．ｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　９９．２８％，ＲＳＤ　ｗａｓ　０．７３％（ｎ＝６）．Ｔｈｅ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｇｏｏｄ，ＲＳＤ　ｗａｓ　０．１４％（ｎ＝６）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｅａｓｉｌｙ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｙ，ｗｉｔｈ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ，ｗｈｉｃｈ　ｃａｌｌ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　Ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ　Ｏｉｎｌｍｅｎｔ　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ；Ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ　Ｏｉｎｔｍｅｎｔ；ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ；ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　苯佐卡因软膏为医院制剂，是苯佐卡因单方制剂，具有局部　置１００　ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度摇匀，得苯佐卡因　对照品溶液（质量浓度为１００　Ｉｘｇ／ｍＬ）。取苯佐卡因软膏０．１０　ｇ，　置５０　ｍＬ容量瓶中，加甲醇３０　ｍＬ，置超声水浴中加热溶解（水浴　温度４０℃），待溶液降至室温，加甲醇至刻度摇匀，得供试品溶　麻醉作用，临床用于皮肤瘙痒与黏膜和创面、溃疡面及痔疮的镇　痛等。目前医院制剂质量规范的含量测定方法为永停滴定法，而　永停滴定仪的适用范围较窄。本试验的目的是通过高效液相色谱　法检测苯佐卡因软膏的含量，建立一个准确、可靠的检测方法。　１仪器与试药　液。另吸取空白基质（除苯佐卡因外的软膏基质）０．１０　ｇ，同法制备　空白溶液。　Ｗａｔｅｒｓ　６００高效液相色谱系统（２９９６检测器、７１７自动进样　器、Ｅｍｐｏｗｅｒ数据系统）；ＢＰ２１１Ｄ　１０万分之一天平（德国Ｓａ￣ｏｆｉｕｓ　公司）。苯佐卡因对照品（药用原料，永停滴定法测得含量为　９９．２％）；苯佐卡因软膏（哈尔滨医科大学附属一院制剂室）；甲醇　为色谱纯，水为超纯水（自剂），其余试剂均为分析纯。　２　方法与结果　２．１　色谱条件　２　３　波长选择及专属性试验　取对照品溶液１０　Ｌ进样，在２００～４００　ｎｍ波长范围内扫　描，得最大吸收波长。空白溶液和供试品溶液分别进样１０　Ｌ。结　果显示苯佐卡因在２９１　ｎｍ波长处有最大吸收，而其他成分在该　波长处无吸收，故选择２９１　ａｍ波长作为检测波长，取空白基质和　苯佐卡因没有干扰。将空白基质和供试品按２．１项下操作所得溶　液和对照品溶液，各取１０　Ｌ进样，得色谱图。由图１可见，方法　专属性强，且杂质不影响主成分测定。　２．４　方法学考察　分析柱：ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ　ＯＤＳ—ＢＰ柱（２５０　ｍｍ　ｘ４．６　ｍｍ，５　Ｉｘｍ）；　流动相：甲醇一水一冰醋酸（８０：２０：０．５）；柱温：２５℃；流速：　１．０　ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：２９１　ｎｍ。　２．２　溶液配制　线性关系考察：分别进样苯佐卡因对照品溶液２．５，５．０，　１０．０，１５．０，２０．０，３０．０　ｔｘＬ，以对照品质量浓度Ｃ（￣ｇ／ｍＬ）为纵坐　标、峰面积Ａ为横坐标进行线性回归，得回归方程ｌ，＝１．１９　ｘ　取１０５℃干燥至恒重的苯佐卡因对照品１００　ｍｇ，精密称定，　加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，备用。取已知含量的供试品溶液　果采用的两种提取溶剂二氯甲烷和三氯甲烷，对提取率均无显著　２．５，５，７．５　ｍＬ，分别精密加入上述质量浓度为１６．４７，１Ｏ．９８，　５．４９［ｚｇ／ｍＬ的对照品溶液２５　ｍＬ和稀盐酸１５　ｍＬ，按２．２项下　影响，故选择了毒性相对较小的二氯甲烷作为提取溶剂；同时，还　考察了水解步骤中使用稀盐酸和硫酸对试验结果的影响，发现经　供试品溶液制备方法制成加样回收样品液，按拟订的色谱条件进　行测定，计算回收率。结果见表１。　２．４样品含量测定　硫酸处理过的样品容易发生氧化，影响提取效率；另对稀盐酸量　加入量进行了摸索，表明试验用量提取较完全。本试验建立的方　法重现性、准确度、灵敏度均符合含量测定的要求，是检测大黄素　的有效方法。　参考文献：　【１］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［Ｍ］．北京：中国医学　科技出版社，２０１０：１９４—１９５．　精密吸取３批样品各１０　ｍＬ，按２．２项下方法制备供试品溶　液，按拟订的色谱条件进样５　３　讨论　进行测定，计算含量。结果３批　样品中大黄素含量分别为０．０５５　２，０．０５４　１，０．０５８　５　ｇ／Ｌ（ｎ＝３）。　试验过程中考察了提取溶剂、提取方法对提取率的影响，结　（Ｓｔ稿日期：２０１１—１０—１７；修回日期：２０１２—０２—１５）