亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的三聚氰胺

2008年b11er月2008色Chinese谱loV0126N．0．6NovemJournafChromatography759～762摘要：建立了亲水作用色谱电喷雾串联质谱测定原料奶及奶制品中三聚氰胺的方法一。样品采用，1％三氯乙酸水溶液乙腈(体积比为一l：1)混合溶液提取混合型阳离子交换反相固相萃取柱(MCX)富集净化亲水作用色谱柱分，。离电喷雾串联四极杆质谱仪进行检测，结果表明三聚氰胺的质量浓度在，．0．05—10，．0mg／L范围内具有良好的．线性关系。原料奶及奶制品中的三聚氰胺在0．5，2．505和10mme,／kg3。个添加水平下平均回收率为763％一987％．，相对标准偏差均小于68％；定量限(彤Ⅳ一>10)为0．g／kg关键词：亲水作用色谱电喷雾串联质谱；三聚氰胺；原料奶；奶制品中图分类号：0658文献标识码：A文章编号：10008713(2008)06075904———栏目类别：技术与应用Abstract：Aemethusodforthedeterminatioracnofnemeclaminmeresidueinerawcmsilkraanddairypnrodunctsmwasdesveeclopdinghydrophilic—intetiohrola，atographyressoleintrotheptytiosamoizationtadetramassptrometrytrichloesu(HILICroaceESIMS／MS—)．ThmemvineidueneesplenaWasWasexc—tedwith1％dthan—ticacwas—id．acetonitrilec(1：1ecaex／v)clutioc．Thduehusomgeateecenotnt．fugedionanpernatantsoe×coeHeexted．ThtrateWasleanenpingmixd—mdezecaexchge(MCX)．slidphatraction~ddgseanaradthtionconcentratedrm，andaanalydbyHILICESIMS／MSsThmgradient4．chromatographicpwasmpermfoedtatusengibniuhydrophilicilicadecoacelumtonn(250masco6bilmmese，5／Lm．)Dufrwith10toormmol／LoamonroiuacefeerWas(PHwe3ll．0re)—anitrilethethemnmoanphpsaseseitstheerhydrphilicpwppertye，meclametainewd．onluaderatedecomecomeounds．IteffetrotivpralyiorenduizmcednmmatrixffectasuanAtripleequrdrupleuamassptromantequippdithanlecsyaetiosourceemploydfotheqelitativeneanrodqucetitativeomomeasuremenetofmelamine．Theroulaniewasreqfiedtinmusingthfragmtspduedfrn}thprootonatedmelamineansionthrfomghromultipleteacamtioonitoring(MRM)nianpositivio—mdew．TwmMRMtronitionestheptonadmeleinenion76an．127z(m／3％ean}85dm／zs127pike68)ereoitor10edm．Thaveragemrecoveireswerebro．tweeucd98lativee．7％sinthedrannswgeerefO5to．ng／kgi．rawilkaneddairyrfompd—ts．dthmretandarddeviatioolessth>an60an．8％．Thmelin．earranemegwas0．05se󰀀toc10tive．0eg／Ld．ThlimitefquantificationN(S／o10)mWas05ag／kgThrthodishighlyanalemansensitivofrthemeasurementsroacfmelaineddequatefothelysisofmela—nieniwrawormilkanoddairypnteridutioctsn．Ktyds：hydr—philic—chroinmatographym—e；lectrosprayionizcationtandemmassspecrometry(HILICESIMS／MS)—；melame；rawilkdairyproduts收稿日期：20081028—通讯联系人：严丽娟博士主要研究方向为食品安全检测技术，，．Tel：(0592)3269943，E—mail：yan]j@xmciqgo．v．cn．基金项目：国家质量监督检验检疫总局科研计划项目(2007IKl37)．・７５０・　色　三聚氰胺（ｍｅｌａｍｉｎｅ）是一种三嗪类含氮杂环　有机化合物，含氮量高达５５．７％。食品工业中常常　需要测定食品中的蛋白质含量。由于直接测定蛋白　质在技术上比较复杂，所以通常通过测定氮原子的　含量间接推算食品中蛋白质的含量（即凯氏定氮　法）进行测定。由于三聚氰胺与蛋白质相比含有更　高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在食　品和饲料中以造成蛋白质含量较高的假象，从而造　成诸如２００７年美国宠物食品污染事件和２００８年三　鹿奶粉事件等严重的食物安全事故。近期卫生部等　五部门联合发布了乳制品及含乳食品中三聚氰胺临　时管理限量值，婴幼儿配方奶粉中三聚氰胺的限量　值为１　ｍｇ／ｋｇ，液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配　方奶粉以及含乳１５９６以上的其他食品中三聚氰胺　的限量值为２．５　ｍｇ／ｋｇ，高于限量值的产品一律不　得销售。因此，为了确保人民的身体健康，建立原料　奶及奶制品中三聚氰胺快速、准确的测定方法具有　重要的意义。　三聚氰胺属于化工原料，因此关于食品中三聚　氰胺的检测研究较少，其检测手段主要包括液相色　谱法¨　、气相色谱－质谱法　、液相色谱．质谱法　等　。其中，液相色谱．质谱法可提供待测物的　结构信息，具有灵敏度高、准确可靠等优势，因而是　检测三聚氰胺的理想方法。三聚氰胺是强极性化合　物，在传统的反相Ｃ　色谱柱上保留很差，需要在流　动相中添加离子对试剂才能获得良好的保留与分　离。然而，流动相中的离子对试剂极大地限制了质　谱作为检测器的使用。亲水作用色谱（ＨＩＬＩＣ）是采　用极性固定相、高含量极性有机溶剂－水相缓冲液为　流动相的一种分离技术，能有效地解决强极性化合　物在反相色谱中保留弱或难以保留的问题，而且易　于实现与质谱的联用。　本文建立了亲水作用色谱－电喷雾串联质谱　（ＨＩＬＩＣ—ＥＳＩ—ＭＳ／ＭＳ）测定原料奶及奶制品中三聚　氰胺的方法。原料奶及奶制品等样品采用ｌ％三氯　乙酸水溶液－乙腈（体积比为１：１）混合溶液提取，混　合型阳离子交换反相固相萃取柱（ＭＣＸ）富集净化，　亲水作用色谱柱分离，电喷雾串联四极杆质谱仪进　行检测。该方法检出限低、重复性好、定性可靠、定　量准确，适合于生产过程的监控和进出口把关检测　的高灵敏度确证和定量分析。　１　实验部分　１．１仪器与试剂　Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００液相色谱仪（美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；　ＡＰＩ　３０００串联三重四极杆质谱仪（美国应用生物系　谱　第２６卷　统公司），配有电喷雾离子源。Ａｌｌｅｇｒａ　５４Ｒ高速冷　冻离心机（美国Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）；固相萃取　装置（美国Ｓｕｐｅｌｃｏ公司）；旋涡混合器；氮气浓缩　仪。Ｗａｔｅｒｓ　Ｏａｓｉｓ　ＭＣＸ萃取小柱（３　ｍＬ，６０　ｍｇ）。　三聚氰胺标准品购自Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司，纯　度≥９９％。乙腈和甲醇均为色谱纯，其他试剂为分　析纯。超纯水由Ｍｉｌｌｉ　Ｑ系统（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）　制得。　１．２液相色谱与质谱条件　１．２．１色谱条件　Ｗａｔｅｒｓ　Ａｔｌａｎｔｉｓ＠ＨＩＬＩＣ　Ｓｉｌｉｃａ色谱柱（２５０　ｍｍ　×４．６　ｍｍ，５　ｍ）。流动相：２００　ｍｍｏＶＬ乙酸铵水　溶液（ｐＨ　３．０）－乙腈（体积比为５：９５）（Ａ）和１０　ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵水溶液（ｐＨ　３．０）（Ｂ）；梯度洗脱程　序：０＿＋６　ｍｉｎ，流动相Ｂ由０线性增至４５％；６．１　ｍｉｎ　时降至０并保持至１２　ｍｉｎ；流速为１．０　ｍＬ／ｍｉｎ。　柱温３５　ｏＣ；进样量：５　Ｌ。　１．２．２质谱条件　电喷雾电离源（ＥＳＩ）；正离子扫描；喷雾电压５　ｋＶ；离子源温度５００　ｏＣ；辅助加热气流量８　Ｌ／ｍｉｎ。　多反应监测扫描模式（ＭＲＭ）：聚焦电压１５５　Ｖ；人　口电压ｌ０　Ｖ；出口电压１２　Ｖ；去簇电压４４　Ｖ；停滞时　间２００　ｍｓ；其他质谱参数见表１。　表１　多反应监测扫描模式的质谱参数　离　离　碰撞能量　相　度　碎片离子　（ｍ／ｚ）　（ｍ／ｚ）　Ｖ　％　。　…～　１２７．１　８５．１’　２５　１００　［Ｍ＋Ｈ—Ｈ２ＮＣＮ］　６８．１　３７　２９　［Ｍ＋Ｈ一　ＮＣＮ—ＮＨ３］　定量离子　１．３标准工作液的配制　准确称取适量的三聚氰胺标准品，用甲醇．水　（体积比为１：１）溶解并定容，配成质量浓度为１　ｇ／Ｌ　的标准储备液；根据需要将其逐级稀释，配成适当质　量浓度的标准工作液，于４　ｏＣ下保存。　１．４样品前处理　１．４．１提取　称取２　ｇ（精确至０．０１　ｇ）液体样品或者１　ｇ（精　确至０．０１　ｇ）已粉碎好的固体样品于５０　ｍＬ具塞离　心管中，加入１０　ｍＬ　１％三氯乙酸水溶液．乙腈（体　积比为１：１）混合溶液，充分振荡２　ｍｉｎ，超声提取　２０　ｍｉｎ，以８　５００　ｒ／ｍｉｎ速率离心ｌ０　ｍｉｎ，上清液待　净化。　１．４．２净化　依次用３　ｍＬ甲醇和３　ｍＬ水活化ＭＣＸ固相萃　取柱，然后将提取液全部过柱，弃去流出液；依次以　３　ｍＬ水和３　ｍＬ甲醇淋洗萃取柱，在淋洗剂流过固　第６期　严丽娟，等：亲水作用色谱一电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的三聚氰胺　・７６１・　相萃取柱后继续抽气２　ｍｉｎ使萃取柱充分干燥；最　后用３　ｍＬ　５％氨化甲醇溶液洗脱ＭＣＸ柱；收集洗　脱液，并将其于４０℃下用氮气吹干，再以１　ｍＬ乙　腈－水（体积比为１：１）溶液溶解，经０．４５／ｚｍ滤膜过　滤，滤液供液相色谱－串联质谱仪测定。　２结果与讨论　２．１提取和净化条件的优化　原料奶和奶制品的基质成分复杂，蛋白质含量　高，因此样品前处理尤为重要。三氯乙酸有沉淀蛋　白质的作用，酸性条件有助于三聚氰胺的溶解。近　期发布的国家标准ＧＢ／Ｔ　２２３８８—２００８　的液相色　谱一质谱／质谱法中，采用１％三氯乙酸水溶液－乙腈　（体积比为４：１）混合溶液作为提取溶剂；但对于部　分脂肪含量较高的样品，高速离心后仍有少量的悬　∞口０Ｌ０＿浮物，且难以过滤去除，严重影响后续的净化步骤的　３　２　２　０　５　Ｏ　进行。本文实验发现，采用１％三氯乙酸水溶液－乙　腈（体积比为１：１）混合溶液提取，经高速离心后，溶　液较为澄清；这是由于提高提取溶剂中的乙腈含量，　有利于样品中脂溶性物质的溶解，因而有效地避免　了上述现象。　ＭＣＸ固相萃取柱的填料是一种混合型强阳离　子交换、水可浸润性聚合物吸附剂，对于强极性碱性　化合物具有良好的净化效果。在酸性条件下上样，　三聚氰胺保持阳离子形态与萃取柱填料上的磺酸基　发生相互作用从而被吸附，依次用水、甲醇淋洗除去　弱酸性和中性化合物，再用氨化甲醇溶液调节ｐＨ　值为碱性，此时三聚氰胺呈中性从而被甲醇洗脱下　来。通过ＭＣＸ固相萃取柱的净化，能够有效地去　除基质干扰，提高检测灵敏度和准确性。　２．２　色谱和质谱条件的优化　三聚氰胺含有多个氨基，是一种强极性化合物，　在传统的反相Ｃ　。柱上保留很差，在电喷雾质谱中　存在较为严重的离子抑制现象，影响定量分析的准　确性。国家标准ＧＢ／Ｔ　２２３８８—２００８　液相色谱一质　谱／质谱法中采用强阳离子交换与反相Ｃ。。混合色　谱柱，虽然在一定程度上改善了三聚氰胺的保留，但　是仍然存在柱效低和分离效果较差的缺点。本研究　选择Ｗａｔｅｒｓ　Ａｔｌａｎｔｉｓ＠ＨＩＬＩＣ　Ｓｉｌｉｃａ色谱柱，利用亲　水作用色谱原理进行分离，流动相中的有机组分为　弱洗脱剂，水相为强洗脱剂，化合物按照亲水性增加　的顺序依次流出，因此三聚氰胺在该色谱柱中可获　得很好的保留。我们还考察了流动相中缓冲液的浓　度和ｐＨ等条件对分离的影响，发现流动相为ｌ０　ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵、ｐＨ为３．０时，ＨＩＬＩＣ柱显示出较　好的分离性能，并且具有较好的稳定性和重现性。　本研究还对喷雾电压、离子源温度、碰撞气、入　口电压、出口电压、去簇电压及碰撞能量等参数进行　了优化，以获得分子离子与特征碎片离子最大的灵　敏度。图１显示了在优化条件下三聚氰胺标准溶液　（０．２　ｍｇ／Ｌ）、空白奶粉样品和空白奶粉加标样品　（添加水平为０．５　ｍｇ／ｋｇ）的色谱图。从图１中可以　看出，三聚氰胺在所使用的亲水作用色谱柱上具有　较强的保留，能够与干扰杂质充分分离，有效地减轻　了基质效应的影响，使定量结果更加准确可靠。　：　三骤　氰胺　一　ａ　　１　Ｏ　Ｏ　　Ｏ　５　Ｏ　６　８　１０　１２　ｔ／ｍｉｎ　＆　Ｕ　、　爸　昌　尝　图１　（ａ）三聚氰胺标准溶液（０．２　ｒａｇ／Ｌ）、（ｂ）奶粉空白　样品和（ｃ）空白奶粉中添加０．５　ｍｇ／ｋｇ三聚氰胺　的多反应监测（ＭＲＭ）总离子流色谱图　２．３线性范围和回收率　取一系列三聚氰胺标准工作溶液（０．０５，０．１，　０．５，１．０，５．０和１０．０　ｍｇ／Ｌ），以峰面积　和对应的　质量浓度Ｃ（ｍｇ／Ｌ）绘制标准曲线。结果表明，三聚　氰胺在０．０５～１０．０　ｍｇ／Ｌ范围内，其质量浓度与对　应的峰面积呈现良好的线性关系，相关系数ｒ＝　【＼占　ｇ　ｕＩ∞４　Ｌ１　５・７６２・　色　谱　第２６卷　０．９９８。在空白原料奶和奶制品中添加三聚氰胺标　准溶液，按信噪比（Ｓ／Ｎ）大于１０计算，本方法的定　量限（ＬＯＱ）为０．０５　ｍｅ．／ｋｇ。　重复测定６份样品，按上述实验方法测定，各个添加　水平的回收率和精密度数据见表２。由表２可以看　出，在０．５，２．５和ｌ０　ｍｅ，／ｋｇ　３个添加水平下，所有　取经检验不含三聚氰胺的牛奶、奶粉、奶酪、巧　克力和饼干空白样品，分别向样品中添加０．５，２．５　和ｌ０　ｍｇ／ｋｇ的三聚氰胺标准溶液，每一添加水平　样品的回收率在７６．３％～９８．７％之间，相对标准偏　差在２．３％～６．８％之间，表明该方法具有较好的准　确度和精密度。　％　表２原料奶和奶制品中三聚氰胺的加标回收率和精密度实验结果　２．４实际样品测定　２００８，３９２（３）：５２３　采用本方法对近期（２００８年９月１５日起）的原　［２］杨云霞，刘彤，周桂英，等．分析测试学报，２００８，２７（３）：　３２２　料奶及奶制品进行检测，检测了包括液体奶、奶粉、　奶酪、巧克力、饼干、咖啡、麦片、糖果、冰淇淋等１０　余个品种近６００个样品，结果有４６个样品检测出三　聚氰胺，三聚氰胺含量为０．０５－４０５　ｍｇ／ｋｇ。　［３］　ＦＤＡ／ＯＲＡ　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｃｅｎｔｅｒ．ＧＣ—ＭＳ　ｓｃｒｅｅｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｍｅｌａｍｉｎｅ，ａｍｍｅｌｉｎｅ，ａｍｍｅｌｉｄｅ　ａｎｄ　ｅｙａｎｕ－　ｔｉｃ　ａｃｉｄ．（２００７－０４－１０）．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｖｍ／ＧＣＭＳ．　Ｍｅｌａｍｉｎｅ．ｈｔｍ　［４］ＫｉｍＢ，Ｐｅｒｋｉｎｓ　Ｌ，ＢｕｓｈｗａｙＲ，ｅｔ　ａ１．ＪＡＯＡＣＩｎｔ，２００８，９１　（２）：４０８　３　结论　上述结果表明，所建立的亲水作用色谱一电喷雾　串联质谱联用法具有较宽的线性范围、较低的定量　［５］　丁涛，徐锦忠，李健忠，等．色谱，２００８，２６（１）：６　［６］　李爱军，张代辉，马书民，等．分析化学，２００８，３６（５）：６９９　［７］蔡勤仁，欧阳颖瑜，钱振杰，等．色谱，２００８，２６（３）：３３９　［８］　黄芳，黄晓兰，吴惠勤，等．分析测试学报，２００８，２７（３）：　３１３　限、较高的回收率和较好的重现性，适用于原料奶和　奶制品中三聚氰胺的日常检测。　参考文献：　［１］Ｒｏｂｅｒｔｏ　Ｍ，ＳｉｌｖｉａＧＣ，ＤａｎｉｅｌＲ。ｅｔ　ａ１．ＡｎａｌＢｉｏａｎａｌＣｈｅｍ．　［９］Ｆｉｌｉｇｅｎｚｉ　Ｍ，Ｐｕｓｃｈｎｅｒ　Ｂ，Ａｓｔｏｎ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｊ　Ａｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，２００８，５６（１７）：７　５９３　［１０］Ａｎｄｅｒｓｅｎ　Ｗ，Ｔｕｒｎｉｐｓｅｅｄ　Ｓ，Ｋａｒｂｉｗｎｙｋ　Ｃ．ｅｔ　ａ１．Ｊ　Ａｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，２００８，５６（１２）：４　３４０　［１１］　ＧＢ／Ｔ　２２３８８．２００８