轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

动物科学与动物医学　２００２年５月第１９卷第５期（总第８３期）　２５　轮状病毒ＶＰ４基因的克隆与核苷酸序列分析　王鹏雁　，陈创夫　，余　龙。，徐若然。，涂长春。。张高轩　（１．新疆石河子大学动物科技学院，新疆石河子８３２００３；　２．解放军军需大学军事兽医研究所，吉林长春１３００６２）　摘要：用反转录聚台酶链式反应（ＲＴ　ＰＣＲ）｛更术，从鞋姨病毒感染的细胞中扩增了８１６ｂｐ的ＶＰ４　片段中抗原表位区　通过Ｔ４　ＤＮＡ连接酶将其直接连接干克隆载体质枉ｐＧＥＭ　Ｔ上，转化至受体　菌ＤＨ５　中　提取盾柱经ＰＣＲ扩增、酶切鉴定．证明重组质粒ｐＴ—Ｖ４中台有靶虢病毒的ＶＰ４基固　片段。经棱苷馥序列分　，表明克隆了轮状病毒主要儡护性抗原ＶＰ４基固中抗犀表位区＝　关键词：靶状病毒；保护性抗原・ＶＰ４基医；基固竟隆　中圈分类号：ｓ８５２．６５　９．４　文献标识码　Ａ　文章编号　１００８—９３８１（２００２）０５—００２５—０４　轮状病毒（Ｒｏｔａ　ｖｉｒｕｓ　ＲＶ）属于呼肠孤病毒科　产品；ＡＭＶ反转录酶、ＲＮａｓｉｎ、ｄＮＴＰ、ｐｆｕＤＮＡ聚　（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｓｅ）轮状病毒属（Ｒｏｔａｖｉｒａｓ）又名双层病毒　合酶、Ｔａｑｐｌｕｓ　ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４．ＤＮＡ连接酶为大　（Ｄｕｏｖｉｒｕｓｅｓ１，是引起婴幼儿和各种幼龄动物非细　连宝生物公司产品；质粒提取用试剂盒、ＤＮＡ片段　菌性腹泻的主要病原之一。ＲＶ性腹泻是一种世界　回收与纯化试剂盒为北京鼎国公司产品；ｐＧＥＭ—Ｔ　性传染病。在动物性腹泻中，自首次报道来，世界各　载体质粒为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品。　地陆续发现了ＲＶ性腹泻。我国亦有猪、牛、羊、犬、　１．３细胞　兔和多种禽类的ＲＶ感染报道，并已发现或分离鉴　ＭＡ一１０４细胞为军需大学病毒室传代，一７０ｃ　定了病毒　一。动物感染ＲＶ后对生产和生长有较大　保存．按常规方法培养、传代，生长液为含有５　小　影响，造成严重的经济损失。目前疫苗预防是控制此　牛血清、３　的谷氨酰胺、双抗的ＭＥＭ．ｐＨ值７．２～　病的最佳选择。随着分子生物学深人研究．现已明确　７．４；维持液为不含血清的ＭＥＭ。　ＲＶ的外壳蛋白ＶＰ４不但是ＲＶ血清型分型依据，　１．４引物的设计　而且是主要的保护性抗原　。］　因此，利用基因工程　根据对从ＧｅｎＢａｎｋ获得的ＲＶ毒株ＶＰ４序列　技术，将ＶＰ４基因表达出来作抗原，已成为国内外　所作的同源性分析结果，设计了两对简并引物，引物　轮状病毒基因工程苗研究的主要方向。　核苷酸组成如下：　本研究用反转录聚合酶链式反应（ＲＴ—ＰＣＲ）技　ＶＰ４的引物：　术，从轮状病毒感染的细胞中克隆了８１　６ｂｐ的ＶＰ４　ｐＦＶ４：５＇－ＧＧ　ＣＴＡ　ＴＡＡ　ＡＡＴ　ＧＧＣ　ＴＴＣ一３。　片段。核苷酸序列分析表明，克隆的ＶＰ４片段包含　ｐＲＶ４：５＇－ＴＣＴ（ＡＧ）ＴＴ（ＡＧ）（ＴＣ）Ａ（ＴＣ）　了ＶＰ８＊片段、胰酶作用区及ＶＰ５＊片段Ｎ端一部　ＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＣ　ＴＴＴＣＣ一３’　分，涉及了ＲＶ的抗原区，对于轮状病毒疫苗的研制　扩增ＶＰ４基因中包含ＶＰ８＊片段、胰酶作用区　具有重要意义，为下一步基因工程苗的开发打下了　及ＶＰ５＊片段Ｎ端一部分８１　６ｂｐ的基因片段；引物　基础。　由上海生物工程公司合成。　１材料和方法　１．５病毒的接种、收获　１．１病毒与菌株　细胞长成单层后准备接种。接毒前病毒用２Ｏ　猪ＲＶ为军需大学军事兽医研究所病毒室分离　＃ｇ／ｍＬ的酶作用３０　ｒａｉｎ，然后用无血清的ＭＥＭ将　保存；受体菌株ＤＨ５ｅ为军需大学军事兽医研究所　单层细胞洗两遍，按１　的量接种病毒，３７℃温箱孵　保存　育１～２　ｈ后，将病毒液倒掉，补足营养液３７ｃ、５　１＿２试剂　ＣＯ：培养，每天观察病变，当ＣＰＥ达到９Ｏ　时收毒　ＲＮＡ提取用ＴＲｌｚｏｌ试剂为ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司　备用。　维普资讯 http://www.cqvip.com

２６　ＡｎｉｍａＩ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　８Ｌ＂Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｖｏ１．１９　Ｎｏ．５（Ｔｏｔａｌ　Ｎｏ．８３）　１　６轮状病毒总ＲＮＡ的提取　Ｒ＿＼Ａ　用ＴＲｌｚｏｌ试剂，按说明书操作，从收集细胞中　提取总ＲＮＡ。提取的ＲＮＡ取样在１　琼脂糖凝胶　上进行电泳检查总ＲＮＡ的完整性　１．７　ＲＴ—ＰＣＲ扩增目的基因　２　２病毒总ＲＮＡ的提取由ＲＶ感染ＭＡ１０４细　胞提取的总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果见图１　由图　可见提取的总ＲＮＡ很完整，没有降解　２　３　ＲＴ　ＰＣＲ用提取的总ＲＮＡ为模板反转录成　ｃＤＮＡ后，经ＰＣＲ扩增在ｌ　琼脂糖凝胶中检查．　以ＤＬ２０００为Ｍａｒｋｅｒ，在７５０　ｂｐ与１　０００　ｂｐ之问　取提取的ＲＮＡ　１０　ｕＬ　１００Ｃ加热２　ｍｉｎ，使双　链ＲＮＡ变性，冰浴２　ｍｉｎ后瞬时离心．再加入５×　ＡＭＶ　Ｂｕｆｆｅｒ　４　Ｌ＋ｄＮＴＰｓ　２　Ｌ；下游引物１　Ｉ　（２５　ｍ０ｌ／　Ｌ）；ＲＮａｓｉｎ　１　Ｌ；反转录酶ＡＭＶ　２　Ｌ；后　扩增出与预期大小相符的条带．约为８］６　ｂｐ，结果　用水补齐２０止的反应体系　４２Ｃ反转录１　ｈ　取一　洁净灭菌的０　２ｍＬ的ＥＰ管，在５０　ｕＬ反应体系中　加入：１０ＸＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　５　Ｌ；ｄＮＴＰｓ（２．５　ｍｍｏ１）４　Ｌ｝上游引物ｌ　Ｌ；下游引物１　Ｉ　；ｃＤＮＡ　２　Ｌ｝　Ｔａｑｐｌｕｓ　０．２止；ｄｄＨ　Ｏ　３６．８　Ｌ。反应条件为：　ＶＰ４：９４℃预变性５　ｒａｉｎ一９４℃３０　ｓ一４３℃３０　ｓ一７２℃　９０　Ｓ，３Ｏ　ｃｙｃｌｅｓ后７２℃７ｍｉｎ　反应结束后取５　Ｌ　ＰＣＲ产物１　琼脂糖凝胶上进行电泳，观察，照相　１．８　ＶＰ４基因的克隆　见图２　圈－，－３　囤１感染细胞提取的ＲＶ总ＲＮ．、　Ｍａｒｋｅ　Ｆ　Ｊ）Ｌ２０９ｕ　将含有目的基因片段的ＤＮＡ溶液与Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ混合．在１　琼脂糖凝胶中，以５～７　Ｖ／ｃｍ的　电压在ｌ×ＴＡＥ中电泳至目的片段与杂带完全分　离，在长波紫外灯下切取含有目的片段的凝胶条，然　后用鼎国的ＤＮＡ片段纯化和回收试剂盒回收目的　基因片段。方法按说明书操作。将回收的目的片段　连接Ｔ一载体，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，蓝白斑筛选转化　菌落，快速鉴定阳性菌落，小提质粒经酶切、ＰＣＲ分　析和检视ｊ阳性重组子。　Ｌ　９核苷酸序列分析　盈２　ＶＰ４　ＰＣＲ产物　２．４　目的片段的回收纯化　用鼎国的回收试剂盒　对目的片段进行纯化，纯化后的产物取１　ｕＬ在１　采用Ｓａｎｇｅｒ’Ｓ双脱氧末端终止法用Ｔ７聚合酶　以通用引物对重组质粒中的插入片段进行序列测　定。　琼脂糖凝胶中检查．结果无非特异性带存在。　２．５　ＶＰ４基目的克隆　将回收的目的片段经Ｔ４　ＤＮＡ连接酶与ｐＧＥＭ—Ｔ载体连接后，转化受体菌　ＤＨＳａ，布于含有ＡＭＰ的Ｉ　Ｂ琼脂平板上，３７　ｃ培养　ＭＡ１０４细胞常规传代．细胞形　１２　ｈ，挑取其中几个白斑菌落，接种含有ＡＭＰ的　ＬＢ培养液，３７　Ｃ过夜培养后，采用ｃｒａｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　２结果　２．１病毒的培养态正常时按１　量接种ＲＶ后继续培养。在接毒后　ｌ０　ｈ出现ＣＰＥ。细胞边界开始模糊不清；ｌ３　ｈＣＰＥ　快速抽提质粒．进行１　琼脂糖电泳．结果含有目的　片段的重组质粒迁移率比载体的迁移率慢（见图　较明显。细胞聚集．呈岛屿状；细胞融合．有合胞体形　成；出现核固缩，空泡化；太片脱落区｛没有脱落的细　胞出现拉网现象，细胞变细，胞浆相连；此时ＣＰＥ达　９Ｏ　以上．故一部分收毒冻存；一部分冻融三次，取　一３）。同时酶切、ＰＣＲ重组质粒，可扩出与预期大小相　符的条带。从而表明．已克隆出了ＶＰ４基因并成功　构建了含有ＶＰ４基因的重组质粒ＰＴ—Ｖ４。　２．６　ＶＰ４基因的核苷酸序列分析　为了证明插入　管离心后用上清进行ＥＭ检查病毒粒子．可见　ＲＶ的典型车轮状粒子．照相保存。用冻融三次后的　病毒再进行２代传毒，出现同样较明显的ＣＰＥ，２Ｏ　ｈ　的重组质粒ＰＴ—Ｖ４中的ＶＰ４基因片段的正确性，　利用双脱氧末端终止法测定了其核苷酸序列。分析　结果表明，插入的ＶＰ４基因的阅读框架是正确的。　收毒冻存，取其中一瓶的细胞抗淀准备提病毒的总　维普资讯 http://www.cqvip.com

动暂科学与动物医学　２００２年５月第ｌ　９卷第５期（总第８３期）　ＦＹＩ　ＩＰＲＮＱＥＥＫＣＴ　ＥＹｌＮＨＧＬＰＰｌ　ＱＮＩＲＮｖｖＰＶＳ　而且，其核苷酸序列与国外报道的核苷酸序列同源　性分别为：ＶＰ４：６６　４　～９２．５　；氨基酸的同源性　分别为：ＶＰ４：６２．８　～９５．５　；核苷酸序列及推导　的氨基酸序列如图４所示　ＬＳＡＲＥＩＶＨＴＲ　ＡＱＶＮＥＤＩＶＶＳ　ＫＴＳＬＷＫＥＭＱＣ　ＮＲ　ｂ　ａ：ＶＰ４的核苷酸序列ｂ：ＶＰ４的核苷酸序列推导的氨基酸　圈４　ＶＰ４的核苷睦序列爱推导的量基睦　３讨论　ＶＰ４是由第４基因节段编码的非糖基化，有血　凝活性的蛋白。大部分ＲＶ的ＶＰ４长２　３６２　ｂｐ，但　Ｈｕａｎｇ　Ｊ．Ａ．ｅｔ　ａ１．（１　９９３）在对澳大利亚３个猪ＲＶ　测序分析时发现ＭＤＲ—Ｂ的ＶＰ４长２　３６８　ｂｐ，比报　道过的最长ＶＰ４还长６个ｂｐ。将不同ＲＶ代表株的　１，３．９　ＰＴ—Ｖ　２　ｐＧＥＭ　Ｉ　ＶＰ４基因插入杆状病毒载体，构建成能表达ＶＰ４的　重组体，后用这种ＶＰ４蛋白免疫肠鼠制备了抗ＶＰ４　抗体并用这种抗血清建立的ＲＶ分型中和试验即Ｐ　血清型（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ　１９９０　ｐａｄｉｌａ—ＮｏｒｉｅｇａＬ　１９９３，　图３　ＶＰ４　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＧＧＣＴＡＴＡＡＡＡ　ＴＧＧＣＴＴＣＧＣＴ　ＣＡＴＴＴＡＴＡＧＡ　ＣＡＡＣ　ＴＡＣＴＴＡ　Ｃ　Ｉ’ＡＡＴＴＣＡＴＡ　ＣＡＣＡＧＴＣＡＡＴ　ＣＴＴＣＣＴ　ＧＡＣＧ　ＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡ　ＧＡＴＴＧＧＡＴＣＡ　ＧＣＴＡＡＧＴ　ＣＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＡＣ　ＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴ　ＧＧＴＣＣＡＴＴＣＧ　ＣＡＣＡＡＡＣＡＧＧ　ＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡ　ＧＴＴＡＡＴＴＧＧＧ　Ｓｅｒｅｎｏ　ＭＭ　１９９４）　。其中Ｐ５以后多见于动物。应　当指出的是，在Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ等建立的分型方法之前，　还有根据ＶＰ４核苷酸序列推断出氨基酸序列并作　了分析，按用源性高低而作的ＲＶ　ＶＰ４分型，用此　法可将ＲＶ分成１５个ＶＰ４型（Ｅｓｔｅｓ　ＭＫ　１　９８９，　Ｓｅｒｅ１１０　ＭＭ　１９９４，Ｇｅｒｎａ　Ｇ，　日ｔ１．１　９９４）　Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ　ＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡ　（　ＡＣＴＡＡＴＧＡＣ　ＴＣＣＡＣＡＡＣＴＧ　ＴＣ　ＧＡＧＣＣＧＴＴ　ＡＴＴＡＧＡＴＧＧＴ　ＣＣＡＴＡＣＣＡＡＣ　ＣＡＡｔ＂一　ＣＡＣＴＴＴ　ＣＡＡＴＣＣＡＣＣＡ　ＡＣＡＡＧＣＴＡＴＴ　ＧＧＧＴＡＣ　ＴＡＣＴ　ＴＧＣＧＣＣＡＡＣＴ　ＧＴＡＧＡＧＧＧＣＧ　ＴＡＡＴＴＡＴＴＣＡ　ＡＧＧＡＡＣＡＡＡＣ　ＡＡＴＡＣＣＧＡＴＡ　ＧＡＴＧＧＴＴＧＧＣ　ＣＡＣ—　等认为Ｐ血清型这个名称应当用于鉴别ＲＶ的　ＴＡＴＡＣＴＡ　ＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡ　ＡＣＧＴＡＣＡＡＡＣ　ＡＡＣ　ＶＰ４抗原性方面，建议用ＶＰ４序列分析所作的ＲＶ　分型称为基因型，以示区别，实际上这两种分类方法　完全一致，例如ＰＩＡ血清型都属于基因８型。　ＴＡＡＣＡＧＡ　ＡＴＡＴＡＣＡＡＴＣ　ＴＴＴＴＴＧＧＴＣＡ　ＧＣＡＡＧ　ＴＡＡＣＴ　ＴＴＡＴＣＧ（　ＴＧＧ　ＡＧＡＡＴＡＣＧＴＣ　ＡＣＡＧＡＣＡ　ＣＡＡ　ＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡ　ＴＴＧＡＴＧＴＧＡＧ　ＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧ　Ｒｖ的ＶＰ４位于病毒颗粒表面，并形成脊状突　起。研究表明，ＶＰ４有许多功能，包括病毒血凝素，　ＣＣＡＡＣＡＧＧＡＡ　ＧＴＴＡＴＡＣＧＣＡ　ＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡ　ＴＴＧＴＴＣＴＣＴＡ　ＣＡＣＣＡＡＡＡＴＴ　ＡＴＡＣＧＣＴＧＴＡ　ＡＴ—　ＧＡＡＡＴＴＣＡ　ＧＴＧＧ＿ｒＡＧＡＡＴ　ＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴ　ＡＡＴＧ　ＧＡＡＣＣＡ　ＣＡＣＣＡＡＡＣＧＣ　ＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡ　ＴＡＣ—　细胞附着和穿人，与病毒毒力有关，在组织培养中与　限制增殖有关，并对胰蛋白酶敏感（Ｇｒｅａｎｂｅｒｇ　ＨＢ　１　９８３，ＫＭｉｃａ　ＡＲ，１９８３．０ｆｆｉｃｅ　ＰＡ，１　９８６，Ｍｕｔ—　ＴＡＴＴＣＡＡ　Ｃ　Ｉ’ＡＣＴＡＡＴＴＡ　ＴＧＡＣＡＣＡＧＴＡ　ＡＡＴＡＴ　ＧＡＣＡＴ　ＣＡＴＴＴＴＧＴＧＡ　ＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴ　ＡＴＡ（　（　ＡＡ　ｔｉｏｎ　ＮＭ　１９９４，Ｅｓｔｅｓ　ＭＫ　１　９９６）。进一步研究证实，　ＶＰ４在胰酶作用下可裂解为带氨基末端的ＶＰ８＊　（２８　０００、ａａ１　２４０）与带羧基端的ＶＰ５＊（６０　０００、　ａａ２４８—７７５）两个片段　ＶＰ４作为病毒主要的交叉中　和抗原，其中和抗原位于保守的ＶＰ４抗原表位区，　Ｅｓｔｅｓ和Ｃｏｈｅｎ，Ｌａｒｒａｌｄｅ等一　均认为ＶＰ８＊片段　ＧＡＡ　ＡＴＣＡＡＧＡＡ（　Ａ　ＡＡＡＡＴＧＴＡ（　Ｔ　ＧＡＧＴＡＴＡＴＣＡ　ＡＴＣＡＴＧＧＡＴ　Ｉ　ＡＣＣＴＣＣＴＡＴＡ　ＣＡＡＡＡＴＡＣＡＡ　ＧＧＡＡＴＧＴＴ（　Ｔ　ＧＣＣＡＧＴＡＴＣＴ　ＴＴＡＴＣＧＧＣＴＡ　ＧＡＧＡ　ＧＡＴＡＧＴ　ＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡ　ＧＣＴＣＡＡＧＴＴＡ　ＡＴＧＡＧ　ＧＡＴＡＴ　ＴＧＴＴ（　ＴＴＴＣＡ　ＡＡＡＡＣＴＴＣＡＣ　ＴＴＴＧＧＡＡＡ—　ＧＡ　ＡＡＴＧＣＡＡ　Ｉ、ＧＣ　ＡＡＣＡＧＡ　ａ　包含了ＶＰ４主要抗原位点　氨基酸序列测定发现，　ＧＹＫＭＡＳＬＩＹＲ　ＱＩ　Ｉ　ＴＮＳＹＴＶ　Ｉ　ＰＤＥＩＱＥｌＧＳ　ＡＫＳＱＤ—　ＶＴｌ　Ｐ　ＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰ　Ｖ　ＷＧＡＧＥＴＮＤ　ＳＴＴＶＥＰＬＬＤＧ　ＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰ　ＴＳＹＷＶＩ　Ｉ　ＡＰＴ　ＶＥＧＶＩＩＱＧＴＮ　ＮＴＤＲ　ＷＬＡＴｌｌ　ｌＥＰ　ＶＱＴＴＮＲ　ＩＹ　ＬＦＧＱＱＶＴ　ＬＳＶＥＮＴＳＱＴＱ　ＷＫＦＩＥｌｖＳＴＴ１、ＰＴＧＳＹＴＱＨＧＰ　Ｉ　ＦＳＴＰＫＬＹＡＶ　ＭＫＦｓ．　ＧＲＩＹＴＹ　ＮＧＴＴＰＮＡＴＴＧ　ＹＹＳＴＴＮＹＤＴＶ　ＮＭＴＳＦＣＤ—　ａａ２４７和ａａ２４１及附近的ａａ序列是高度保守，其保　守性在无毒力的ＲＶ中比有毒力者中更高，且此区　域负责ＶＰ４血清特异性中和反应。Ｌａｒｒａｌｄｅ等　（１　９９１）报道在ＶＰ８＊片段ａａ８０—１８Ｏ区为ＶＰ４血清　型特异位置，并认为仅对这一区域测序即可判定　ＶＰ４型别，且ＶＰ８－Ｒ＂片段在相同ＶＰ４血清型间表　维普资讯 http://www.cqvip.com

２８　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｖｄ．１９　Ｎｏ，５（ＴｏｔＭ　Ｎｏ．ｇ３）　现为高度保守，而ＶＰ５＊片段抗血清则在不同Ｐ型　间有交叉反应。肖玮等　（１９９８）对北京地方株ＶＰ４　血清型特异片段编码基因的序列分析也显示，此区　域ＡＡ在不同型之间高度变异，而在同型间高度保　守，表明此区构成ＶＰ４中和反应抗原位点，与Ｇｏ—　ｒｉｚｉｇｌｉａ的结果一致。Ｑｆａｎ（１９９１），Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ（１９９８）　胰酶裂解片段ＶＰ８＊上。国内也有人克隆了人的　ＶＰ４部分或全长基因，但是动物中未见有野毒株　ＶＰ４基因的克隆。为此，我们扩增并克隆了分离株　猪ＲＶ的ＶＰ４中涉及抗原活性的部分基因，为下一　步研制基因工程苗提供了理想的基因材料。　参考文献　等也认为此区间可用于ＶＰ４的分型及探针分析。关　于胰酶作用位点，多报道在ａａ２４０、ａａ２４６中，且几乎　所有毒株中保守，ａａ２４５处的潜在作用位点可促进　胰酶作用，从而与毒力密切相关　孙茂盛（１９９７）　用重组杆状病毒表达了病毒ＳＡ１ｌ株的ＶＰ４蛋白，　表达的ＶＰ４蛋白能被抗ＲＶ的Ａｂ所识别，表达产　二版　１　殷震，刘景华等，动物病毒学［Ｍ］．北京：科学出版社，第　２　Ｋａｐｉｋｉａｎ　Ａ　Ｚ，Ｃｈａｎｏｃｋ　Ｒ　Ｍ．Ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ　Ｂ　Ｎ—Ｋｎｉｐｅ　Ｄ　Ｍ，Ｃｈａｎｏｃｋ　Ｒ　Ｍｔ　ｅｔ　ａ１．ｅｄｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．　Ｎｅｖｅ　Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ．１９９０，１３５３－１【４０４　３　Ｑ’Ｒｙａｎ　Ｍ　Ｌ，ｅｔ　ａｔ．Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，１９９０：１　６２（４）：８１０—８１６　物占总蛋白的１０　，免疫动物后可产生高水平抗　ＳＡ一１１的中和Ａｂ，Ａｂ能阻断ｓＡ１１病毒在ＭＡ１０４　细胞上的ＣＰＥ，说明重组杆状病毒表达的ＶＰ４蛋白　具有良好的抗原性和免疫原性。陈元鼎等（１９９７）　。　。以昆虫病毒ＦＨＶ外壳蛋白为载体的外源抗原表位　表达系统（ＦＨＶ—ＲＮＡ２载体系统）．在ＰＥＴ一３和重　组杆状病毒系统中构建和表达了ＶＰ４胰酶切割位　点区上、下游和重叠区３个ＡＡ片段，结果表明这些　ＡＡ序列具有很强的免疫性，可诱导豚鼠产生很强　的血清中和抗体。１９９８年他们进一步研究了这些抗　原表位，结果表明，这些表位所诱导的动物血清抗　体，具有广泛识别同源及异源血清型ＲＶ抗原的能　力，以及体外中和这些同源及异源血清型ＲＶ病毒　感染性的能力，结果提示ＲＶ胰酶切割位点区的　ＡＡ序列具有重要的免疫学功能．可以作为新一代　ＲＶ抗原表位亚单位疫苗的候选疫苗抗原　目前国外已成功克隆了ＶＰ４全基因并测定了　其桉苷酸序列，且已报道了ＶＰ４上抗原表位位于其　４　Ｊ，萨姆布克Ｅ，Ｆ等［美］，金冬雁等译．分子克隆实验指　南［Ｍ］．北京　科学出版社．第２版．１９９２　５　Ｅｓｔｅｓ　Ｍ　Ｋ，Ｃｏｈｅｎ．Ｊ　Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃ—　ｔｉｏｎ口］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｒｅｖ．Ｉ　９８９，５３ｉ４１０　４４９　６　Ｌａｒｒａｌｄｅ　Ｇ　ｔ　Ｌｉ　Ｂ—Ｋａｐｉｋｉａｎ　Ａ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｒｏｔｙｐｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｐｉｔｏｐｅ（ｓ）ｐｒｅｓｅｎｔ　ｏｎ　ｖｐ８　ｓｕｂｕｎｉ　ｏｆ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ＶＰ４　ｐｒｏ—　ｔｅｉｎ［Ｊ］，Ｊ　Ｖｉｔｏ１．１９９１．６５　３２１３　３２１８　７　Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ　Ｍ　Ｇ，Ｌａｒｒａｌｄｅ　Ｇ．Ｋａｐｉｋｉａｎ　Ａ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉ—　ｇｅｎｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ａｍｏｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｄｅｔｅｒ—　ｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｏｕｔｅｒ　ｃａｐｓｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＶＰ４［Ｊ３．Ｐｒｏｅ．ＮａｔＩ．Ａ．　ｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１　９９０．８７（１８）：７ｌ　５５　７１５９　８　Ｉ．ａｒｒａｌｄｅ　Ｇ，Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ　Ｍ　Ｇ—ｅｌ　ａ１．Ｊ．ＶｌｒｏＩ．１９９２，６６：　４３８　７４４３　９　肖玮，钱渊等．人Ａ组轮状病毒北京地方株ＶＰ４血清型　特异片段编码基因的序列分析＿】］微生物学报，１∞８，３８　（３）：１９７－２０３　１０孙茂盛等，中国医学科学院学报，１９９７，１９（１）：４８—５３　１１陈元鼎，刘名英，赵玮等．重组轮状病毒ＳＡ１１ＶＰ４抗原　表位诱导广泛交叉中和抗体反应口：．中国病毒学，　１９９８．１３（１）：５７—６３　Ｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ＶＰ４　Ｗａｎｇ　Ｐｅｎｇｙａｎ＝ｌ＝ｔＹｕ　Ｘｉｎｇｌｏｎｇ　ｔＣｈｅｒｔ　Ｃｈｕａｎｇｆｕ：。，Ｘｕ　Ｘｉｎｇｒａｎ－。．Ｔｕ　Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ［。．Ｚｈａｎｇ　Ｇａｏｘｕａｌｌｔ【口　（１．Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ，８３２００３；　（２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｏｔｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｊｉｌｉｎ　１　３００６２）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ＶＰ４　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｙｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｅｌｌ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎ　ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ），ｔｈｅｌｅｎｔｈ　ｏｆｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅｓｗａｓ　８１６ｂｐ　ａｎｄ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆＲＴ—ＰＣＲｗｅｒｅｌｉｇａｔ—　ｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｉａｓｍｉｄ　ｐＧＥＭ—Ｔ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｅｄ　ｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨＳａ．Ｂｙ　ｔｈｅ　ａ￣ａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎ￣ｃ］ｅａｓｅ　ａｎｄ　ＰＣＲ．ｔｈｅ　ｆｒａｇ　ｍｅｒｉｔｓ　ｏｆ　ＶＰ４　ｗｅ他ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ＰＴ　Ｖ４　ｘＮｅｙ￣ｃｏｎｓｔｒｕｅｔｅｄｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｈａｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ．　．Ｔｈｅ　ｒＥ－ｓ　ｔｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ　ｓｅｑｌｉｅｎｃｉｎＥ　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒｏｔａｖ　Ｊｒｕ￥；ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ￣ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　（收稿日期：２００２一Ｏ卜３１）