鸟苷酸发酵工艺优化

中国调味品　第４３卷第７期　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ　基础研究　２０１８年７月　鸟苷酸发酵工艺优化　刘晨　，丁长河¨，金少举。，陈复生　，杜娟　（１．河南工业大学食品学院，郑州４５０００１；２．河南省南街村　（集团）有限公司，河南漯河４６２０００）　摘要：鸟苷酸具有显著的增鲜、辅助抗肿瘤、提高机体免疫力以及调节机体营养代谢等作用，因而广泛应　用于食品和医药领域。发酵以枯草芽孢杆茵变异菌株为出发菌株，在单因素试验基础上，采用正交试验　对发酵培养基及发酵条件对鸟苷产量的影响进行研究，结果表明：葡萄糖添加量为１Ｏ　，发酵温度为　３６℃，发酵时间为７２　ｈ时，鸟苷产量可达到１０．６　ｇ／Ｌ，较优化前提高了７１　９，５。　关键词：鸟苷酸；发酵；工艺　中图分类号：ＴＳ２０１．５６　文献标志码：Ａ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—９９７３．２０１８．０７．００４　文章编号：１０００－９９７３（２０１８）０７－００１５－０６　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＧＭＰｓ　ＬＩＵ　Ｃｈｅｎ　，ＤＩＮＧ　Ｃｈａｎｇ—ｈｅ¨，ＪＩＮ　Ｓｈａｏ—ｊｕ。，ＣＨＥＮ　Ｆｕ—ｓｈｅｎｇ　，ＤＵ　Ｊｕａｎ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　４５０００１，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｈｅｎａｎ　Ｎａｎｊｉｅｃｕｎ（Ｇｒｏｕｐ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｌｕｏｈｅ　４６２０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｕａｎｙｌａｔｅ　ｉｓ　ｗｉｄｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｆｏｏｄ　ａｎｄ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｆｒｅｓｈｎｅｓｓ，ａｓｓｉｓｔｉｎｇ　ｉｎ　ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ，ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｏｄｙ．Ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒｉａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｓｔａｒｔｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ｆｏｒ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　ａｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ。Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｖｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｉｓ　１　Ｏ　，ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｉｓ　３　６℃，ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｉｓ　７２　ｈ，ｔｈｅ　ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｒｅａｃｈｅｓ　１０．６　ｇ／Ｌ，ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　７１　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｂｅｆｏｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｕａｎｙｌａｔｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　鸟苷酸作为组成核酸的５种核苷酸之一，具有独特　营养代谢，能够促进肝功能恢复、调节机体免疫功能、抗　的香菇样鲜味，因其鲜味阈值达到０．０１２５　ｇ／ｄＬ，常被用　癌等［３　］，使鸟苷酸成为极具开发潜质的医药原料。此　于增强食品的鲜味［１］。在食品工业中主要以其钠盐（鸟　外，鸟苷酸具有的抗氧化活性，对神经的生长影响非常　苷酸二钠）的形式作为食品添加剂，用作调味料、酱油、　大［７－１０］，可以保护细胞免受活性自由基的侵害。鸟苷酸　味精的原料，通常与谷氨酸盐一起用于增强食品的鲜　在食品以及药品工业中都起着不可估量的作用。　味［２］。在医药领域，鸟苷酸具有高度的生物活性，可以　鸟苷酸的生产方法有酶水解ＲＮＡ法、菌体自溶　提高机体免疫力、辅助抗肿瘤、促进生长以及调节机体　法、发酵法和化学合成法４种方法。鸟苷酸生产工艺　收稿日期ｔ２０１８－－０２—０８　＊通讯作者　基金项目：中国博士后科学基金资助项目（２０１６Ｍ６０２２４４）　作者简介ｔ刘晨（１９９Ｏ一），女．硕士，研究方向：鸟苷酸发酵工艺优化及功效；　丁长河（１９６８一），男．副教授．博士，研究方向：低聚糖和食品发酵。　一１５—　第４３卷第７期　２０１８年７月　中国调Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ　味品　基础研究　目前运用最广泛的是发酵转化法，利用一定微生物，以　数显气浴恒温振荡器（ＳＨＺ一２Ａ）　金坛华峰仪器有限　葡萄糖作为碳源生产鸟苷，再利用生物或化学方法将　其转化为鸟苷酸，如鸟苷磷酸化得鸟苷酸，且工业化生　产鸟苷酸的方法就是采用鸟苷发酵的二步生产　法［ｎ，ｌｚ］。　公司；电子天平（ＪＹ５００２）　上海舜宇恒平科学仪器有　限公司；电热恒温水浴锅（ＤＫ一９８—１Ｉ）　天津市泰斯特　仪器有限公司。　目前，我国鸟苷酸发酵得率较国外先进水平低，鸟　苷酸工业化生产还未成熟，如何提高鸟苷酸产量成为　２　试验方法　２．１菌种活化　研究的重中之重。本文研究发酵培养基配方及发酵条　菌种定期活化，取斜面保藏菌种划线接种于活化　件对鸟苷产量的影响，通过单因素试验及正交试验对　发酵培养基的组成及发酵条件进行优化￣１３，１４］，得到最　佳发酵工艺，提高鸟苷酸发酵得率。　１　试验材料　１．１　菌种　枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）变异菌株：由河　南省南街村（集团）有限公司提供。　１．２培养基　１．２．１斜面培养基（９，６）　蛋白胨１．０；氯化钠０．５；牛肉膏粉０．３；琼脂１．５。　１．２．２种子培养基（　）　蛋白胨１．０；牛肉膏０．３；氯化钠０．５。　１．２．３发酵培养基（　）　葡萄糖１２．０；酵母粉１．６；玉米浆０．２；谷氨酸钠　１．０；磷酸氢二钾０．２；氯化钙０．２；碳酸钙２．０；硫酸铵　２．０；硫酸镁０．０５。　１．３主要试剂　葡萄糖（ＡＲ）、硫酸镁（ＡＲ）、碳酸钙（ＡＲ）、氯化钙　（ＡＲ）、磷酸氢二钾（ＡＲ）、硫酸铵（ＡＲ）、氢氧化钠　（ＡＲ）、氯化钠（ＡＲ）、乙腈（ＨＰＬＣ）：天津市科密欧化　学试剂有限公司；谷氨酸钠（ＢＲ）：Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；酵母浸　粉（ＢＲ）、牛肉膏（ＢＲ）、蛋白胨（ＢＲ）、营养琼脂（ＢＲ）：北　京奥博星生物技术有限责任公司。　１．４主要仪器　高效液相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）安捷伦科技公司；电热恒温培养箱（ＤＮＰ－　９０５２）　上海精宏实验设备有限公司；手提式压力蒸汽　灭菌器（ＤＳＸ－２８０Ｂ）上海申安医疗器械厂；单人单面　净化工作台（ＳＷ—ＣＪ－１ＦＤ）　苏州净化设备有限公司；　台式低速离心机（ＴＤＬ－５Ａ）　金坛市医疗仪器厂；漩　涡振荡器（ＵＶＳ一１）　北京优晟联合科技有限公司；电　子万用炉（ＤＬ—１）北京市永光明医疗仪器有限公司；　一】６一　斜面，置于恒温培养箱中３６℃恒温静置培养２４　ｈ。　２．２摇瓶种子培养　在５００　ｍＬ三角瓶中加入５０　ｍＬ种子培养基，　８层纱布封口，置于高压灭菌锅中在１２１℃下灭菌　１５　ｒａｉｎ，在恒温水浴锅中恒温至３６℃，接种１环或　２环斜面保存菌种，３６℃，１００　ｒ／ｍｉｎ，在恒温振荡培养　箱中培养１２～１５　ｈ。　２．３发酵培养　在５００　ｍＬ三角瓶中加入２７　ｍＬ种子培养基，８层纱　布封口，置于高压灭菌锅中在１２１℃下灭菌１５　ｍｉｎ，在恒　温水浴锅中恒温至３６℃，接种种子液３　ｍＬ，３６℃，　１１０　ｒ／ｍｉｎ，在恒温振荡培养箱中培养７２　ｈ。　２．４正交试验设计　将发酵培养基中葡萄糖、酵母粉、玉米浆、谷氨酸　钠等成分及发酵条件如温度、发酵时间、ｐＨ等进行单　因素试验，再选取对鸟苷产量有显著性影响的单因素，　考虑因素间交互作用进行三因素三水平正交试验。　２．５发酵样品预处理　准确吸取发酵样品０．１　ｍＬ于１Ｏ　ｍＬ离心管中，　用４　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ定容至１Ｏ　ｍＬ，混合均匀，沸水浴　５　ｒａｉｎ，再以３０００　ｒ／ｒａｉｎ离心５　ｒａｉｎ。取离心后上清液　１　ｍＬ，稀释定容至１００　ｍＬ，供测定。采用高效液相色　谱法测定发酵液中的鸟苷含量，柱子：Ｃ１ｅ，流动相：乙腈：水　为１Ｏ：９Ｏ，流速：１　ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长：２５６　ｒｉｍ，柱温：　２５℃，进样量：１０　Ｌ［　］。　３　结果和讨论　３．１　发酵培养基对鸟苷产量的影响　３．１．１葡萄糖浓度对鸟苷产量的影响　选取葡萄糖浓度８　，１Ｏ　，１２　，１４　，１６　９，６　５个　水平，在发酵条件为菌种培养时间１２　ｈ、接种量１Ｏ％、　发酵时间７２　ｈ、发酵液ｐＨ　７．０、发酵温度３６℃时，葡　萄糖浓度与鸟苷产量关系见图１。　第４３卷第７期　中国调味品　基础研究　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ　２０１８年７月　删　｛Ｌ　扭　图１　葡萄糖浓度与鸟苷产量关系　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　由图１可知，当葡萄糖浓度为１２　时，鸟苷产量　最高，达到７．６　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：葡萄糖浓度为　１２　时鸟苷产量与８　，１４　，１６　３组之间存在极显　著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），与葡萄糖浓度１Ｏ　组之间存在　显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５），葡萄糖浓度对鸟苷产量有显　著性影响。　３．１．２酵母粉浓度对鸟苷产量的影响　发酵条件同３．１．１，葡萄糖浓度为１２　９，６，选取酵母　粉浓度为１．２　，１．６　，２．０　，２．４　９，５，２．８　５个水平　进行鸟苷发酵，酵母粉浓度与鸟苷产量关系见图２。　ｈ　蜩　｛Ｌ　｛扭　聊’　图２酵母粉浓度与鸟苷产量关系　Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｐｏｗｄｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　由图２可知，在酵母粉浓度为１．６％时，鸟苷产量　最高，达到６．５　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：酵母粉浓度为　１．６　时鸟苷产量与１．２　，２．０％，２．４％，２．８　４组　之间均存在极显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），鸟苷产量呈现　先上升后下降的趋势；酵母粉浓度达１．６　之后，随着　酵母粉含量增加，反而对鸟苷发酵有抑制作用。　３．１．３玉米浆粉浓度对鸟苷产量的影响　发酵条件同３．１．１，葡萄糖浓度为１２　，酵母粉浓　度为１．６　，选取玉米浆粉浓度０．１　，０．１５　，０．２　，　０．２５　，０．３　５个水平，玉米浆粉浓度与鸟苷产量关　系见图３。　咖　｛Ｌ　｛扭　圈３玉米浆粉浓度与鸟苷产量关系　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｎ　ｓｔａｒｃｈ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　由图３可知，玉米浆粉浓度为０．２　时，鸟苷产量　最高，产量达到６．２　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：玉米浆粉　浓度为０．２　时，鸟苷产量与０．１　，０．１５　，０．２５　，　０．３　４组之间均存在极显著性差异（Ｐ＜０．０１），鸟苷　产量呈现先上升后下降趋势；玉米浆粉浓度达１．６　之后，随着浓度增加，反而不利于鸟苷产量积累。　３．１．４谷氨酸钠浓度对鸟苷产量的影响　发酵条件同３．１．１，葡萄糖浓度为１２　，酵母粉浓　度为１．６　，玉米浆粉浓度为０．２　，选取谷氨酸钠浓　度０．８　，１．０　，１．２　，１．４％，１．６％５个水平，谷氨　酸钠浓度与鸟苷产量关系见图４。　ｄ　删　｛Ｌ　杠　０．８　ｌ－０　ｌ＿２　１．４　１．６　谷氨酸钠浓度（％）　图４谷氦酸钠与鸟苷产量关系　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　．由图４可知，当谷氨酸钠浓度为１　时，鸟苷产量　达到７．３　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：谷氨酸钠浓度为１　时鸟苷产量与０．８　，１．２　，１．４％，１．６　４组之间均　存在极显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），谷氨酸钠浓度对鸟苷　发酵有显著影响。　３．１．５硫酸铵浓度对鸟苷产量的影响　发酵条件同３．１．１，葡萄糖浓度为１２　，酵母粉浓度　为１．６　，玉米浆粉浓度为０．２　，谷氨酸钠浓度为１．Ｏ％，　选取硫酸铵浓度为１．０　，１．５％，２．Ｏ　，２．５　，３．０　５个　水平，硫酸铵浓度与鸟苷产量关系见图５。　一１７—　第４３卷第７期　２０１８年７月　中国调味品　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ　基础研究　显著影响。接种量少，培养基得不到充分利用；接种量　删　｛Ｌ　：Ｉ扭　ｌ－０　１．５　２．０　２．５　３．０　硫酸铵浓度（％）　图５硫酸铵浓度与马督产量关系　Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　由图５可知，当硫酸铵浓度为２．０　９，６时，鸟苷产量　达到６．２　ｇ／Ｌ，随着硫酸铵浓度增加，鸟苷产量呈现先　升高后下降的趋势。显著性分析表明：硫酸铵浓度为　２．０　９／５时鸟苷产量与１．０　，１．５　９／６，３．０　３组之间均　存在极显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），与２．５　组之间存在显　著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５）。　３．２不同发酵条件对鸟苷产量的影响　３．２．１接种时间对鸟苷产量的影响　鸟苷产量不仅与发酵培养基配方有关，还与种子　生理性状有很大关系。菌种培养时问不足，转入发酵　培养基中，会出现种子前期生长缓慢，整个发酵周期延　长，产物开始形成的时间推迟等常见的几种现象，甚至　会出现发酵异常现象。菌种培养时间过长，菌体会在　种子培养基中过早自溶，会影响后期鸟苷积累。选取　培养８，１Ｏ，１２，１４，１６　ｈ的种子菌种转入发酵培养基，　接种时间与鸟苷产量关系见图６。　删　｛Ｌ　垃　ＩＬｌ　１２　１４　ｌｂ　不同接种时间（ｈ）　图６．不同接种时间与乌苷产量关系　Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　由图６可知，培养１２　ｈ的种子液转移至发酵培养　基得到鸟苷产量最高，达６．９　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：　接种时间为１２　ｈ时鸟苷产量与８，１Ｏ，１４，１６　ｈ　４组不　同接种时问之间均存在极显著性差异（Ｐ＜０．０１），确　定最适接种时间为１２　ｈ。　３．２．２接种量对鸟苷产量的影响　培养基中营养成分有限，接种量多少对鸟苷积累有　一】８一　过多，培养基营养有限，会对鸟苷积累产生抑制作用。　ｂ　删　｛Ｌ　：｝扭　胛　６　８　１０　１２　１４　接种量（％）　图７接种量与鸟苷产量关系　Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　选取接种量为６％，８　，１Ｏ　，１２　９／６，１４　９／６　５个水　平，随着接种量增加，鸟苷产量呈现先升高后下降的趋　势。由图７可知，当接种量为１Ｏ　时，鸟苷产量达到　６．４　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：接种量为１Ｏ　时鸟苷产　量与６　，８　，１４　９／６　３组不同接种量之间均存在极显　著性差异（Ｐ＜０．０１），与１２　９／６接种量之间存在显著性　差异（Ｐ＜Ｏ．０５），确定最适接种时间为１２　ｈ。　３．２．３　发酵时间对鸟苷产量的影响　选取发酵时间４８，５４，６Ｏ，６６，７２，７８　ｈ　６个水平，　发酵时间与鸟苷产量关系见图８。　一　删　｛Ｌ　垃　４５　５０　６０　６５　７０　７５　Ｕ　发酵时间（ｈ）　图８发酵时间与鸟苷产量关系　Ｆｉｇ．８　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　由图８可知，当发酵时间为７２　ｈ时，鸟苷产量达　到７．９　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：发酵时间为７２　ｈ时鸟　苷产量与４８，５４，６Ｏ，６６，７８　ｈ　５组不同发酵时间之间　均存在极显著性差异（Ｐ＜０．０１），发酵时间对鸟苷产　量有显著性影响。　３．２．４发酵ｐＨ对鸟苷产量的影响　发酵培养基ｐＨ是微生物发酵的一项重要的发酵　参数，是微生物在发酵液中代谢活动的综合指标。ｐＨ　通过影响微生物内酶活力，从而影响微生物生长和产　物积累。　第４３卷第７期　中Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ　国调味品　基础研究　２０１８年７月　删　｛Ｌ　枷　图９发酵ｐＨ与鸟苷产量关系　Ｆｉｇ．９　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐＨ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　选取ｐＨ值为６．６，６．８，７．０，７．２，７．４　５个水平进　行发酵，由图９可知，当ｐＨ值为７．０时，鸟苷产量最　高，达到６．８　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：发酵ｐＨ为７．０　时鸟苷产量与６．６，７．４　２组之间均存在极显著性差异　（Ｐ＜Ｏ．０１），与ｐＨ为６．８组存在显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５），　与ｐＨ为７．２组不存在差异性（Ｐ＞Ｏ．０５），ｐＨ在７．Ｏ～７．２　范围内，鸟苷产量较高。　３．２．５发酵温度对鸟苷产量的影响　温度对微生物发酵有很大影响。温度通过影响微生　物各种酶反应速率，改变微生物代谢调控机制，从而影响　发酵培养基的理化性质，最终影响发酵产物的积累。　媚　｛Ｌ　｛扭　图１Ｏ发酵温度与鸟苷产量关系　Ｆｉｇ．１０　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　试验选取３２，３４，３６，３８，４０℃５个水平，由图１Ｏ　可知，最佳发酵温度为３６℃，此温度下，鸟苷产量最　高，达到８．０　ｇ／Ｌ。显著性分析表明：发酵温度为３６℃　时鸟苷产量与３２，３４，３８，４０℃４组不同发酵温度之间　均存在极显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），发酵温度对鸟苷产　量有显著性影响。　３．３正交试验　正交试验设计和分析方法是目前最常用的工艺优化　试验设计和分析方法。鸟苷酸发酵培养基成分复杂，交　互作用错综复杂，发酵条件对鸟苷产量影响显著，因此，　鸟苷酸发酵培养基和发酵条件优化工作尤为重要。　３．３．１正交试验结果　根据发酵培养基配方单因素试验和不同发酵条件　单因素试验结果，依据单因素对鸟苷产量的显著性影　响、单因素试验的最佳鸟苷产量与因素间交互作用，选　取葡萄糖、发酵温度、发酵时间对鸟昔产量有显著性影　响的３个因素，设计三因素三水平的正交试验，正交试　验的自变量及其水平见表ｌ。　表１正交试验设计表　Ｔａｂｌｅ　１　Ｏｒｔｈ０ｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔａｂｌｅ　为研究因素间的交互作用，采用Ｌｚ，（３ｎ）正交试　验表，见表２。　表２正交试验结果　Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　Ａ　ｅ　ＡＸＢ　Ａ　ｃ　ＡＸＣ　ＡＸＣ２蹦ｃ·蹦ｃｚ　３．３．２正交试验结果分析　直观分析见表３。　表３鸟苷产量均值响应表　Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　一１９—　第４３卷第７期　中国调味品　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ　基础研究　２０１８年７月　由表３可知，以鸟苷产量为评价指标，可知发酵温　度对鸟苷产量影响最大，各因素对鸟苷产量的影响依　次为发酵温度（Ｂ）＞发酵时间（Ｃ）＞葡萄糖浓度（Ａ）。　以鸟苷产量为分析指标，选择鸟苷产量高的组合，通过　直观分析可知最佳组合为Ａ。Ｂ。Ｃ２。　方差分析结果见表４。　表４鸟苷产量方差分析表　Ｔａｂｌｅ　４　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｖｅｒｎｉｎｅ　由表４可知，发酵温度与发酵时间对鸟苷产量影　响达到了极显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５），葡萄糖浓度对鸟　苷产量影响不显著，交互作用对结果均不显著。由此　分析，结合直观分析结果，以鸟苷产量为指标，最佳组　合为Ａ。Ｂ。Ｃ。，即葡萄糖浓度１０％，发酵温度３６℃，发　酵时间７２　ｈ。再次在发酵条件下进行验证性试验，得　到鸟苷产量达到１０．６　ｇ／Ｌ。　４　结论　单因素试验确定了发酵培养基配方中葡萄糖、酵　母粉、玉米浆粉、谷氨酸钠及硫酸铵的最佳浓度，确定　了发酵工艺参数适宜范围，通过正交试验对鸟苷产量　有显著性影响的葡萄糖浓度、发酵时间、发酵温度３个　发酵工艺条件进行优化，确定最优组合为葡萄糖浓度　１０　９，６，发酵温度３６℃，发酵时间７２　ｈ。在此条件下进　行鸟苷发酵试验，鸟苷产量达到１０．６　ｇ／Ｌ，产量较优　化前提高了７１　。　参考文献：　［１］Ａｎｄｏ　Ａ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ－Ｙｏｋｏｙａｍａ　Ｒ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｕａｎｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｂｙ　ｃｏｏｋｉｎｇ　ｏｆ　ｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．Ｎｉｐｐｏｎ　Ｓｈｏｋｕｈｉｎ　Ｋａｇａｋｕ　Ｋｏｇａｋｕ　Ｋａｉｓｈｉ，２０１５．６２（８）：４１７—４２１．　一２Ｏ一　［２］Ｋｉｔｈａｒａ　Ｋ，Ｋａｓｈｉｗａｙａｎａｇｉ　Ｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｕｍａｍｉ　ｔａｓｔｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２０００．１３０（４Ｓ）：９３１·９３４．　［３］Ｆ６ｒｓｔｅｒ　Ｄ，Ｒｅｉｓｅｒ　Ｇ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｐｒｏｔｅｃｔ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｖｉａ　Ｐ２Ｙ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ１．　２Ｏ１６．９４（１０）：５７－６６．　［４］Ｗｅｉ　Ｌ．Ｈａｎｃｏｃｋ　Ｃ　Ｎ，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｊ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｌｉｎｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｕｇｍｅｎｔｓ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ａｅｒｏｂｉｃ　ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ：　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｙｒｉｄｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ．　２Ｏ１５，６（５）：２－８．　［５］Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　Ｇ．Ｇｌａｓｅｒ　Ｔ，ａ／ｈ－ｎｅｕ　Ｃ，ａｔ　ａ１．Ｅｘｔｒａｃｄｌｌｕａｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　ｎｏｖｅｌ，ｕｎｄｅｒａｐｐｒｅｃｉａｔｅｄ　ｐｍｍｅｔｓａｔａｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅ　ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｃｅｕｌａｒ　Ｃａｎｃｅｒ．２０１５，１４（１）：４－１２．　［６］Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ　Ｍ　Ｊ，Ｄａｇｎｅｌｉｅ　Ｐ　Ｃ，Ｔｈｅｕｎｉｓｚ　Ｅ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｅｔａｒｙ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｉｎ　ｉｎｆａｎｃｙ　ａｎｄ　ａｔｏｐｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　ｗｈｅｅｚｅ，ａｎｄ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２０１５．　６Ｏ（５）：６９１－６９３．　［７］Ｋａｐｐｏｃｋ　Ｔ　Ｊ，Ｅａｌｉｃｋ　Ｓ　Ｅ，Ｓｔｕｂｂｌｅ　Ｊ　Ａ．Ｍｏｄｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｎｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０００，４（５）：５６７－５７２．　［８］李蕴．５．－鸟苷酸二钠结晶工艺的研究［Ｄ］．广州ｔ华南理工大　学．２Ｏ１Ｏ．　［９］Ｇｕｄｋｏｖ　Ｓ　Ｖ．Ｓｈｔａｒｋｍａｎ　Ｉ　Ｎ，Ｓｍｉｒｎｏｖａ　Ｖ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｎｏｓｉｎｅ　ｄｉｓｐｌａｙ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｐｒｏｔｅｃｔ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｒｏｍ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ·ａｎｄ　ｓｅｒｖｅ　ａｓ　ｒａｄｉｏ　ｐｒｏｔｅｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｒａｄｉａｔ　Ｒｅｓ，２００６，　１６５（５）：５３８—５４５．　［１０］Ｒａｔｈｂｏｎｅ　Ｍ，Ｐｉｌｕｔｔｉ　Ｌ，Ｃａｃｉａｇｌｉ　Ｆ．ｅｔ　ａ１．Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｅｄｌｌｕａｒ　ｇｕａｎｏｓｉｎｅ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，２００８，２７（６）：６６６－６７２．　［１１］赵谋明．调味品［Ｍ］．北京；化学工业出版社．２００１：２１２—　２３９．　［１２］蔡显鹏，储炬，庄英萍．等．鸟苷发酵代谢过程分析［Ｊ］．食　品与发酵工业。２００２，２８（９）：５－９．　［１３］Ｃａｉ　Ｘ，Ｂａｏ　Ｌ．Ｗａｎｇ　Ｎ．ｅｔ　ａＬ　Ｄｉｅｔａｒｙ　ｎｔｒ．１ｏｃｔｉｄｃｓ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊ　ｕｒｙ　ｉｎ　ａｌｃｏｈｏｌ—ｔｒｅａｔｅｄ　ｒａｔｓ：ａ　ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉ０ｎ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６．２１（４）：３５１－３５２．　［１４］Ｎａｔｈ　Ｍ，Ｓｉｎｇｈ　Ｈ，Ｅｎｇ　Ｇ．Ｃｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５＇－ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　ｍｏｎｏｐｈ０ｓｐｈａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｏｒｇａｎｏｔｉｎ（ＩＶ）　ｍｏｉｅｔｉｅｓ　ｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｃｉｔｖｉｔｙ［Ｊ］．　Ｉｓｒｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２（７）：１６０４－１６１０．　［１５３卢晓萍，廖凤霞，胡元发．ＨＰＬＣ法测定半夏中鸟苷的含量［Ｊ］．　海峡药学．２０１ｌ（８）：７８－７９．