木瓜蛋白酶研究进展

生物化工基础论文

题目：木瓜蛋白酶研究进展 姓名：钱龙 学号;2011425119

摘要：木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶，大量存在于木瓜乳汁中。对其组成成分、结构、制备、固定化、在非水介质中的特性及在医药上的用途等方面的研究进展进行了综述。

关键词：木瓜蛋白酶；固定化；医药用途；进展；展望 前言

木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。 1.木瓜蛋白酶的组分

工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶[EC 3.4.22.2](papain)、木瓜凝乳蛋白酶[EC 3.4.22.6](chymopapain)、木瓜蛋白酶Ω[EC 3.4.22.30](papaya proteinaseΩ，也称papaya peptidase A、papaya proteinase Ⅲ)、木瓜凝乳蛋白酶M [EC3．4．22．25](chymopapain M、papaya proteinase Ⅳ。其中chymopapain的含量最多，占可溶蛋白的45%。其组分又最复杂，含十几种蛋白。但人们还是习惯根据其从离子交换柱出来的先后顺序分为木瓜凝乳蛋白酶A和木瓜凝乳蛋白酶B。

2.木瓜蛋白酶的结构

木瓜乳汁中四种已知半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性，其氨基酸

数目和同源性比较如表1所示。除chymopapain含有8个半胱氨酸外，其余三种酶都只含有7个半胱氨酸。25位的巯基是活性位点，不参与二硫键的形成(chymopapain的117位巯基也不参与二硫键的形成)，其余巯基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性。

人们在不同清晰度下得到了四种酶的X-射线结构。四种酶的肽链折叠方式相似，形成两个大小相同、构型不同的区域。一个是由a-螺旋构成的L-区，另一个是由大量反向平行的片层构成的R-区。活性位点氨基酸残基Cys25，Asnl79和His159就位于这些区域的表面，其中Cys25位于L-区起始a-螺旋上。木瓜蛋白酶家族的Cys25，Gly23，Gly65形成的S1亚部位是一个大口袋，对底物专一性影响较小；S2亚部位由于酶不同其氨基酸组成不同，几何形状亦不同，对酶的性质影响较大。 3.作用机理

木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中 L-精 氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和 L-瓜 木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。这种酶属于内肽酶，能切开蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多 肽类。 是一种存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶 研究进展的最快。木瓜蛋白酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半 胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格， 分子量为 23400，氨基酸残基数 212。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环 境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。 这种酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的 纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活 性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力， 同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶 液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最 适合 PH 值 5.7(一般 3～9.5 皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点 18.75； 最适合温度 55～60℃(一般 10～85℃皆可)，耐热性强，在 90℃时也不会完全失 活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

4.木瓜蛋白酶的制备

木瓜蛋白酶是一种胞外酶，能分泌到乳汁中，所以直接将木瓜乳汁在55～60℃的条件下进行低温真空干燥或喷雾干燥，再经粉碎就可得到木瓜蛋白酶的粗品。为了避免木瓜蛋白酶失活，干燥前可在木瓜乳汁中加入适量的保护剂，保护木瓜蛋白酶中的活性巯基，常用的保护剂有EDTA、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等。将粗品盐析后重结晶可得到稍加精制的木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶的粗品或稍加精制的产品就可直接用于工业生产。但对于在医药上用的木瓜蛋白酶则需要进一步的分离纯化。乙引等[3]对木瓜乳汁进行真空干燥，(NH)2S0沉淀和Sp-Sephadex50柱层析，分别得到了木瓜蛋白酶的粗品、精品和纯化酶，可以满足不同的需要。刘叶青等[4]采用无毒的絮凝剂fc-1与无机助凝剂fc-2对木瓜乳胶预处理，然后用中空纤维超滤膜进行超滤浓缩，使木瓜蛋白酶得到了有效的纯化。齐杰等用一步SephadexG100凝胶层析即得到了一定比活的木瓜蛋白酶，总活力回收为106.2%。

5.木瓜蛋白酶的固定化

对木瓜蛋白酶固定化可以避免其在酸碱和有机介质中失活，实现酶的反复利用；在医药上用固定化的木瓜蛋白酶可以减小其副作用。常用的固定化方法有吸附、载体交联和包埋法。赵慕馨等用壳聚糖为载体，戊二醛作为交联剂，采用载体交联法制备固定木瓜蛋白酶，其固定化酶的活力回收率平均达61.6%。郭刚军等[7]以褐藻酸钙凝胶为载体，用包埋法固定木瓜蛋白酶，用正交实验探讨了最佳的固定化条件，测定了固定化酶的催化特性和动力学性质，为工业运用打下了基础。现在人们不断的开发新型固定化载体和新方法，并取得了较好的效果。欧伶等把木瓜蛋白酶偶联在对氨基苯磺酰乙基(ABSE)-交联琼脂上得到的固定化酶对尿素的稳定性较高。也有人以硅胶为载体，γ-环氧丙基三甲氧基硅烷为偶联剂来固定木瓜蛋白酶。高居易等[等用对甲基苯磺酰氯活化微晶纤维后，与乙二胺反应向载体引入有机胺基团，再用戊二醛处理所得的二次活化载体可以再温和条件下固定木瓜蛋白酶。所得固定化酶活力为103U/g载体，与溶液酶比较，热稳定性有明显的提高。

6.木瓜蛋白酶在非水介质的特性

近年来非水相酶学得到了巨大发展，在有机介质中底物容易溶解，产物容易

分离。木瓜蛋白酶是为数不多的在非水介质中表现出催化活性的蛋白酶，且具有较强的对应体选择性。Ke等[11]研究了在水一有机介质中影响木瓜蛋白酶稳定性的因素，发现除温度外，表面张力、搅拌速率、相体积比对酶的稳定性有显著的影响。Xue等[12]研究了用不同的方法和载体来固定木瓜蛋白酶，然后在有机溶剂中合成二肽，发现把木瓜蛋白酶固定在鸡蛋蛋白上其催化效率最高。Akihiro等[13]用木瓜蛋白酶来催化合成20(S)-喜树碱，其对底物的对应体选择性可达99%。 7.木瓜蛋白酶的用途 7.1.食品工业应用

可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸。用于水解动植物蛋白、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品的营养价值，降低成本。有利于人体的消化和吸收。孙冰玉等[14]报道木瓜蛋白酶能显著提高醇法大豆浓缩蛋白的乳化性能，徐幸莲等[15]、马美湖等[16]均有木瓜蛋白酶是一种良好的肉类嫩化剂的报道。木瓜蛋白酶亦可有效提高白葡萄酒的稳定性[17]。 7.2.医药工业应用

含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。在冈比亚这些缺乏药物的地方，人们利用木瓜果肉中含的酶来治疗小儿烧伤，可以有效的除去腐烂组织而防止烧伤皮肤的感染[18]。木瓜蛋白酶可以促进中药成分的有效煎出。曾惠芳等[19]用木瓜蛋白酶预处理补骨脂粉后煎提，其煎液总氮量提高了2倍，磷脂提高了4倍，补骨脂素、异补骨脂素提高了近1倍。木瓜蛋白酶法对 Rh血型的抗D、抗E抗体等的免疫初期抗体具有良好的检出力。吴毅等[20]对9160例需输血的患者用木瓜酶法进行交叉配血实验，发现有3例木瓜酶型抗-D抗体。杨慧等[21]在木瓜蛋白酶交叉配血中发现了1例木瓜蛋白酶型抗- C、抗-E抗体。

7.3.皮革工业应用

利用木瓜蛋白酶制成脱毛剂，鞣制皮革，具有毛孔细腻，皮纹光亮效果。纺织工业应用：可用于处理羊毛、蚕蛹脱胶、蚕丝精炼，能达到手感柔软、舒适、抗收缩、抗张强度等效果。羊毛织物在碱性过氧化氢体系预处理后，木瓜蛋白酶体系弄那个显著改善羊毛织物的放缩性能[22]。

由于木瓜蛋白酶具有广泛的用途，因此随着科研人员对木瓜蛋白酶的深入研究，将会有更加广阔的发展前景。

7.4美容化妆品工业应用：

将木瓜蛋白酶加入到含有蛋白质和油脂的化妆品中，具有独特的美白嫩肤、 美颜保健、祛斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高产品档次。可制 成减肥茶、美容护肤品等。 7.5日化工业应用：

用于香皂、肥皂、洗涤剂、洗衣粉、洗手液等，去污力强，除菌消毒、安全 放心。

7.6饲料工业应用：

用于饲料添加剂，开发蛋白源，利于吸收，提高饲料的利用率，节约成本， 有助于牲畜消化，加速生长。如在猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、鱼、虾等饲料中添 加。还可以作为蔬菜水果高级复合肥料的添加剂。 7.7皮革工业应用：

利用木瓜蛋白酶制成脱毛剂，鞣制皮革，具有毛孔细腻，皮纹光亮效果。 7.8.纺织工业应用：

可用于处理羊毛、蚕蛹脱胶、蚕丝精炼，能达到手感柔软、舒适、抗收缩、 抗张强度等效果。 7.9.细胞培养：

木瓜蛋白酶在准备细胞培养液（cell culture）的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块 10 分钟后，就可以将连接细胞的细胞外基质打断；然后再用蛋白酶抑制剂停止反应，防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身；最后用 Pasteur pipette 将组织块打散为单细胞悬浮液。

8.最新研究进展

1.利用水相合成的量子点标记木瓜蛋白酶的研究

科学家采用的QD s 直接在水溶液中合成的尺度较均一的被巯基丙酸包覆的 CdTe 纳米粒子。 在选定的pH 值条件下, 通过静电相互作用，使纳米粒子与带正 电荷的生物分子木瓜蛋白酶相结合，并通过光谱数据和TEM 图像证实了这一结 果。本方法简便、快速，为生物医学研究提供了一种非传统的荧光检测新方法。 纳米粒子与生物分子通过静电相互作用相结合的方法简便易行。 通过改变体系的 pH 值, 可以使纳米粒子选择性地标记目标生物分子。这种类型的生物荧光探针 可以作为灵敏的检测试剂或细胞内的示踪剂, 也可以用于细胞表面的标记等研 究。

2．高分子膜载体固定化木瓜蛋白酶

固定化酶载体的选择一直是酶工程研究的重要课题。 PA膜特殊结构的存在使 固定化在很短的时间内完成,减少了固定化过程的酶活损失。以PA膜为载体,戊二醛为交联剂进行固定化木瓜蛋白酶是一种操作简便,条件温和,制备效果较好的固定化酶方法。 9. 展望

制备固定化木瓜蛋白酶的方法很多,从这些大量的研究可以看出,酶经固定 化以后,由于受到载体等因素的影响,其特征会发生某些改变。为此,在固定化酶 的应用过程中,必须了解固定化酶与游离酶性质之差别,掌握这些性质对固定化 酶的应用有重要意义,以适当调整工艺,使其在最适条件下催化反应。 由于研究者 的实验设计等不同,所以很难评价各种固定化方法的优劣。不同方法制备的固定 化木瓜蛋白酶适用范围不同,应根据实际需要确定,以便让技术能更好地服务生 产。 木瓜蛋白酶经各种方法固定后,稳定性增强、最适温度升高、pH 耐受范围增 宽、酶活力提高、半衰期延长等,这表明采用的固定化方法正确,应循序渐进,寻找更佳的结果。在现有已取得的研究成果的基础上,如何进一步地提高固定化酶的活性和对底物的亲和力是今后研究的重点。酶固定化技术的日益成熟将使木瓜蛋白酶在食品、饮料、医药、化学试剂、饲料、纺织及化妆品等方面发挥出更加巨大的作用。

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