2014年4月
摇
摇摇摇摇摇CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES摇摇摇摇摇
高等学校化学学报
摇724~729
No.4
摇摇
doi:10.7503/cjcu20130718
新型核素摇64Cu标记D鄄脱氧葡萄糖及其小动物正电子发射断层扫描显像
洪摇业1,2,朱摇华1,胡摇骥2,林新峰1,卿摇晶2,杨摇志1
恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室,北京100142;
2.中国原子能科学研究院同位素研究所,北京102413)(1.北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所核医学科,
摘要摇为拓展脱氧葡萄糖(DG)在肿瘤代谢显像中的应用,以新型核素摇64Cu标记葡萄糖胺鄄1,4,7,10鄄四氮杂环十二烷鄄1,4,7,10鄄四乙酸(DOTA鄄DG).通过优化反应条件,于25益反应30min后得到高放化纯度和高比活度的标记化合物摇64Cu鄄DOTA鄄DG,标记产物经放射性高效液相色谱(Radio鄄HPLC)检测.体外稳定性实验结果表明,所富集.
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体内,分别于注射后1和3h进行小动物正电子发射断层扫描(Micro鄄PET)显像.结果表明,其在肿瘤部位有
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Cu鄄DOTA鄄DG有良好的稳定性.将摇64Cu鄄DOTA鄄DG通过尾静脉注射入荷瘤肝癌细胞(Hep鄄G2)裸鼠Cu鄄DOTA鄄DG的合成及分子显像研究拓宽了以摇18F鄄氟代脱氧葡萄糖为代表的肿瘤代谢类显像剂的
应用范围,为新型核素标记肿瘤代谢显像剂提供一种新途径.中图分类号摇O615.3摇摇摇摇文献标志码摇A摇摇摇摇
关键词摇2鄄氨基鄄2鄄脱氧鄄D鄄葡萄糖;铜鄄64;正电子发射断层显像;肿瘤
分子影像在肿瘤诊断方面发挥着巨大作用,近年来兴起的正电子发射计算机断层显像(PET/CT)是其中一个重要组成部分.PET/CT检查在肿瘤的分期分型、良性恶性肿瘤的鉴定和疗效评估方面具有明显优势[1].借助PET药物,其可以提供CT或核磁共振显像(MRI)等无法给予的关于肿瘤组织能量代谢的动态生物学信息.目前广泛使用的PET药物氟代脱氧葡萄糖(18F鄄FDG)已不能满足临床个体化诊疗的需要,因此新型PET药物的设计正引起广泛的关注.
肿瘤细胞恶性程度与摇18F鄄FDG摄取量一致,并在细胞内持久增高,而炎症局部葡萄糖代谢比恶性
肿瘤细胞低,对葡萄糖的利用随时间减少.延迟显像提高了诊断原发性肿瘤(特别是肺癌、直肠癌等)的灵敏度、特异性和阳性预测值[2~4],但其常受到摇18F鄄FDG衰减产生的噪声的影响.与核素18F(t1/2=
Cu鄄DOTA鄄Octreotate的显像效果明显优于摇111In鄄DTPA鄄Octreotide[10].
109min)相比,新型核素摇64Cu(t1/2=12郾7h;茁+:0郾653MeV,17郾4%;茁-:0郾578MeV,39%)具有较长半衰期,且可与各种化合物偶联,其产生的茁-粒子可用于肿瘤的放射治疗[5~9].在分子靶向诊疗研究中,
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组[12~14]选择对DG的2鄄位进行修饰,连接配位基团1,4,7,10鄄四氮杂环十二烷鄄1,4,7,10鄄四乙酸(DOTA),并分别进行了单光子核素摇111In(t1/2=67郾9h)和正电子核素摇68Ga(t1/2=1郾1h)的标记;还通过并进行摇111In的标记,得到了可同时用于核素/光学成像的双模态分子探针摇111In鄄NIRF鄄CCPM鄄DG[15].由于单光子核素摇111In的分辨率远低于PET核素,且PET核素摇68Ga的半衰期过短,均不适合DG的延迟显像.因此,发展基于摇64Cu的DG类肿瘤代谢显像剂极其必要.
1,4,7,10鄄四乙酸(NCS鄄Bz鄄DOTA)直接偶联,合成了可用于肿瘤代谢显像的葡萄糖类肿瘤代谢显像剂
收稿日期:2013鄄07鄄26.
基金项目:国家自然科学基金(批准号:81071198,81172082,81371592)和北京市自然科学基金(No.7132040)资助.联系人简介:杨摇志,男,博士,副研究员,主要从事放射性药物方面的研究.E鄄mail:pekyz@163.com
由于脱氧葡萄糖(DG)为代谢型药物,与受体型药物相比,能耐受更大的结构改变[11].本课题
对2鄄DG进行羧基化修饰,将其偶联至可用于红外显像的核交联聚合胶束纳米粒子(NIRF鄄CCPM)上,
本文选择葡萄糖胺为原料,以水为溶剂与2鄄[(4鄄异硫氰基苯基)甲基]鄄1,4,7,10鄄四氮杂环十二烷鄄
摇No.4
摇洪摇业等:新型核素摇64Cu标记D鄄脱氧葡萄糖及其小动物正电子发射断层扫描显像725
标记前体DOTA鄄DG;用医用加速器轰击高纯摇64Ni靶,制得放射性核素摇64Cu;再以摇64Cu对DOTA鄄DG进行放射性标记,高产率得到目标化合物摇64Cu鄄DOTA鄄DG,并对其进行了体外稳定性测试,同时选取荷瘤裸鼠(人肝癌细胞Hep鄄G2)模型进行小动物正电子发射断层扫描(Micro鄄PET)显像.
1摇实验部分
1.1摇试剂与仪器
2鄄[(4鄄异硫氰基苯基)甲基]鄄1,4,7,10鄄四氮杂环十二烷鄄1,4,7,10鄄四乙酸(NCS鄄Bz鄄DOTA)购于美
国Macro鄄cyclies公司;N,N鄄二异丙基乙胺(DIPEA)购于美国Sigma鄄Aldrich公司;2鄄氨基鄄2鄄脱氧鄄D鄄葡萄糖(2鄄DG)、乙二胺四乙酸(EDTA)、N,N鄄二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸盐(PBS)、醋酸钠(NaAc)和新华一号试纸及其它试剂均购于国药集团;所用试剂未经纯化直接使用.
美国BrukerDaltonics公司基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI鄄TOF鄄MS);美国安捷伦公司1200series高效液相色谱仪;美国Bioscan公司B鄄Fc鄄1000HPLC放射性探测器;日本YMC公司YMC鄄PackODS鄄AAA12S05鄄2546WT色谱柱;美国Bioscan公司AR鄄2000型放射性薄层扫描仪;美国99郾09%;美国Bio鄄Rad公司AG1鄄X8Cl型阴离子交换树脂;C鄄30质子回旋加速器由比利时IBA公司和1.2摇实验过程
中国原子能科学研究院联合制造.
1.2.1摇标记前体DOTA鄄DG的合成摇DOTA鄄DG的合成过程如Scheme1所示.取9mg(0郾05mmol)CAPINTEC公司多探头全自动酌计数器.俄罗斯ISOFLEX公司高纯度摇64Ni靶用于制备摇64Cu,丰度为
2鄄DG加入1mLDMF/H2O(体积比为9颐1)溶液中,搅拌至固体全部溶解,在避光条件下加入5郾5mg
(0郾01mmol)的NCS鄄Bz鄄DOTA,再加入20滋L(0郾11mmol)DIPEA,室温(25益)下搅拌反应12h.所得DG,收集淋洗梯度与分析梯度一致,每次进样99滋L,在出现紫外吸收峰0郾4min后手动收集(分析方
产物经分析型HPLC仪检测,目标产物DOTA鄄DG的保留时间为3郾43min.采用该HPLC仪收集DOTA鄄法详见本文支持信息).收集完成后停止原淋洗梯度,调整流动相为100%水相(A)冲洗柱子5min,再次进样,收集,重复3次后,用70%有机相(B)冲洗5min,将柱内杂质冲洗出来,继续进样收集,收集后冷冻干燥.目标产物DOTA鄄DG由MALDI鄄TOFMS验证.
Scheme1摇Synthesisandradiolabelingof摇64Cu鄄DOTA鄄DG
1.2.2摇64Cu的制备、纯化及质量控制摇参照文献[16]方法,在加速器上通过核反应摇64Ni(p,n)64Cu获得摇64Cu.以富集摇64Ni为靶材,使用电沉积法将金属摇64Ni镀于铜靶托的镀金膜上制成靶件,置于C鄄30质子回旋加速器中,用15郾6MeV,37~70滋A束流强度的质子以6毅入射角度轰击摇64Ni靶面2h.轰击完毕,用酸处理反应液,采用阴离子交换法通过AG1鄄X8洗脱分离除去摇64Ni及其它杂质核素,64Cu放射1.2.3摇64Cu鄄DOTA鄄DG的标记摇取1mg/mL标记前体DOTA鄄DG20滋L,加入到150滋L0郾1mol/LNaAc溶液(pH=5郾5)中混匀,继续加入10滋L(81郾4MBq)的摇64Cu2+淋洗液,摇晃均匀,于25益反应30min[17].其标记过程如Scheme1所示,用放射性高效液相色谱(Radio鄄HPLC)监测至反应完毕,对目标产物摇64Cu鄄DOTA鄄DG的放射性峰面积进行积分,得到放化纯度.性核纯度经酌能谱仪确认大于99郾99%.
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1.2.4摇温度、时间和pH值对摇64Cu鄄DOTA鄄DG标记率的影响摇取1mg/mL标记前体DOTA鄄DG20滋L,20,30,40,50,60和70益反应30min,采用Radio鄄HPLC分析产物;取1mg/mL标记前体DOTA鄄DG加入150滋L0郾1mol/LNaAc溶液中混匀,加入放射性活度为37MBq的摇64Cu淋洗液,混匀后分别在20滋L,加入150滋L0郾1mol/LNaAc溶液中混匀,加入放射性活度为37MBq的摇64Cu淋洗液,混匀后于25益分别在10,20,30,40,50和60min时取样,采用Radio鄄HPLC分析产物;取1mg/mL标记前体DOTA鄄DG20滋L,加入150滋L0郾1mol/LNaAc溶液中混匀,加入放射性活度为37MBq的摇64Cu淋洗液,分别调节pH值为3郾6,4郾0,4郾6,5郾0和5郾5,于25益反应30min,采用Radio鄄HPLC分析产物.
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1.3摇Cu鄄DOTA鄄DG的质量控制及体外稳定性实验
参考《医疗机构制备正电子类放射性药品管理规定》,主要检查放射性药物的性状、pH值、放化纯度、放射性活度及氨基冠醚(K2.2.2)、乙腈和乙醇等物质的残留.
稳定性测定:取放射性活度为1郾85MBq的摇64Cu鄄DOTA鄄DG溶液20滋L分别加入1郾0mLPBS(pH=
64
7郾4)和0郾1mol/LNaAc(pH=5郾5)溶液中,于37益孵育,分别在10min,1,2,4,8和20h取出20滋L1.4摇
溶液进行Radio鄄HPLC分析.
Micro鄄PET视野范围小,分辨率高,最高可达1mm.它可以准确反映药物在动物体内的代谢情况.Cu鄄DOTA鄄DG的Micro鄄PET显像
本文通过Micro鄄PET设备观察摇64Cu鄄DOTA鄄DG标记化合物在肿瘤鼠体内的摄取情况.取BALB/c裸鼠(十周龄),右下肢前部植有直径1郾0cm左右的人肝癌细胞Hep鄄G2种植瘤.注射前禁食24h,通过尾静脉注射14郾8MBq的摇64Cu鄄DOTA鄄DG0郾15mL,分别于注射后1和3h进行PET显像.显像前将裸鼠1%(体积分数)异氟烷的氧气麻醉.PET显像结果通过SiemensInveon系统采集,显像时间为10min,所得数据用ASIProVM软件系统分析处理.
在SummitAS鄄1鄄000鄄7小动物麻醉系统中用混有3%(体积分数)异氟烷的氧气麻醉,显像过程中维持含
2摇结果与讨论
2.1摇DOTA鄄DG的合成
参考文献[12,13,18]方法合成DOTA鄄DG,并有所改进.由于DG在DMF中溶解度较低,选取水作溶剂.以葡萄糖胺为原料,DIPEA为催化剂与NCS鄄Bz鄄DOTA偶联反应.以分析型HPLC进行该化合物的分析和分离提纯工作,分析结果见本文支持信息图S1.分离时手动收集淋洗液,收集完毕停止原2.2摇
淋洗梯度,用100%A相冲洗柱子5min,再次进样,该方法可显著缩短纯化时间.
6464
MBq,共50滋L.由于摇64Cu自身优良的核素性质,酌射线比例较小.经进一步的条件优化后,将标记前体和摇64Cu2+淋洗液置于25益反应30min即可.
所得产物经Radio鄄HPLC分析,结果见本文支持信息图S2.在恒比例流动相中,有机相(B相)体
Cu由原子高科股份有限公司提供[16].核素放置于铅块保护的西林瓶中,总放射性活度为407
Cu标记DOTA鄄DG的Radio鄄HPLC分析
3郾06min;而用放射性检测器测得的摇64Cu衰变产生的酌光子的保留时间分别为3郾50,3郾28和3郾54测器所得结果的改变而变化,表明DOTA鄄DG已将摇64Cu螯合.由放射性检测结果(本文支持信息图S2)2.3摇
可见,除目标产物摇64Cu鄄DOTA鄄DG处放射性峰外,无其它放射性峰,放化纯度>95%.
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积分数分别为10%,50%,70%时,用紫外检测器探测得DOTA鄄DG的保留时间分别为3郾03,2郾83和min,2种检测器测得的保留时间差分别为0郾48,0郾45和0郾48min.放射性检测器所得结果随着紫外检
Cu标记DOTA鄄DG的影响因素
(407MBq/50滋L),对得到高放化纯度标记物有积极意义.如图1(A)所示,20,30,40和50益时标记率很高,且基本不变;60益时标记率开始下降,70益时标记率大幅下降,说明反应温度过高不利于标5郾0和5郾5时,标记率基本一致,均达到95%以上(图略).
记.如图1(B)所示,以10min为间隔,20~50min内标记率变化并不明显.pH值为3郾6,4郾0,4郾6,
室温下将DOTA鄄DG加入摇64Cu淋洗液中,所得产物用Radio鄄HPLC分析.
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Cu2+淋洗液比活度很高
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Fig.1摇Influencesofthetemperature(A)andreactiontime(B)onthelabelingefficiency
2.4摇
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99郾99%,未经进一步纯化直接使用.标准化操作无菌无热原,符合放射性药物的质量标准.4h时,
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乙腈,无其它重金属污染.Radio鄄HPLC分析表明,放射化学纯度>95%,酌谱图认证核纯度大于
稳定性研究是药品质量控制的主要内容之一,DOTA鄄DG的稳定性已有报道[12,13].由图2可见,在
Cu鄄DOTA鄄DG在2种溶液中都保持了良好
Cu鄄DOTA鄄DG为无色透明溶液,体积0郾15mL,pH值在5郾0~5郾5之间,不含乙醇、氨基冠醚和
Cu鄄DOTA鄄DG的质量控制及体外稳定性分析
(A)Reactiontime:30min;(B)temperature:25益.
的稳定性(>90%);当时间延长至20h后,其在PBS中仍未见明显解离,而在0郾1mol/L的NaAc(pH=5郾5)中保持有75%放射化学稳定性.这表明即使核素标记化合物拥有较长的物理半衰期,但核素自分解、标记化合物所处的溶液、酸碱性及温度DOTA鄄DG作为代谢型分子显像剂,可在4h内保持放射化学稳定性,有利于其进一步的生物学评价.等因素的影响均会导致其分解.标记化合物摇64Cu鄄
Fig.2摇Invitrostabilityof摇64Cu鄄DOTA鄄DGconju鄄
gateinPBS(a)andNaAc(b)solutions
2.5摇在肝癌裸鼠模型中的PET显像
摇64Cu鄄DOTA鄄DG尾静脉注射进入荷瘤裸鼠模型(人肝癌细胞Hep鄄G2[19]),并分别在1和3h后进行Mi鄄cro鄄PET显像.与摇18F鄄FDG相比,
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在前文[12~15]基础上,借助Micro鄄PET设备进行新型核素标记化合物的快速评价.将标记纯化后的
Cu鄄DOTA鄄DG在脑部的摄取有明显的非特异性降低.表明该分子探
针能够被血脑屏障所屏蔽,不会对脑部造成较大的伤害.Micro鄄PET显像如图3所示,1h时摇64Cu鄄DOTA鄄DG主要在肝部浓积[图3(A)~(C)],其它组织摄取相对较低;3h后肝肾部位浓度较高[图3(D)~(F)],也在肿瘤部位出现富集.这归因于虽然DG亲水性很好,但DOTA中的苯环有一定疏水性,增加了肝脏的非特异性摄取;此外,本文选取的人肝癌细胞Hep鄄G2移植瘤对DG的摄取选择DG可能不适于肝癌肿瘤的显像;而且DOTA螯合的摇64Cu在体内环境中可能不稳定.虽然摇64Cu鄄DOTA性不明显,并且DOTA鄄DG在肝脏处摄取很高,用于诊断肝癌很容易使肝脏病灶部位湮没,64Cu鄄DOTA鄄和摇64Cu鄄1,4,7鄄三氮杂环壬烷鄄1,4,7鄄三乙酸(64Cu鄄NOTA)在体外都有较好的稳定性,Cai等[20,21]研究证7,10鄄四氮杂环十二烷鄄1,4,7,10鄄四乙酸鄄抗细胞膜糖蛋白抗体(64Cu鄄DOTA鄄TRC105)在肝、脾及肾的摄取明显高于摇64Cu鄄1,4,7鄄三氮杂环壬烷鄄1,4,7鄄三乙酸鄄抗细胞膜糖蛋白抗体(64Cu鄄NOTA鄄TRC105).本实验中摇64Cu鄄DOTA鄄DG在肝肾的摄取较高,可能与摇64Cu鄄DOTA在体内不稳定有关.Anderson等[22,23]研究表明,
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实,在前体、核素及其它条件完全相同情况下,使用不同的DOTA和NOTA螯合剂,24h时摇64Cu鄄1,4,
清晰度明显提高.
与99mTc[24~27]和摇111In[14]标记的DG相比,64Cu鄄DOTA鄄DG用于PET显像有很高的分辨率,所得图像
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Cu鄄DOTA注射入小鼠体内后,可能部分脱标解离成摇64Cu离子,本文结果也验证了此点.
很低,难以观测到更长时间DG的代谢,不适宜延迟显像;而摇64Cu的半衰期有12.7h,可以很方便地观察到注射3h后DG的代谢情况.
通过初步Micro鄄PET显像研究可知,
64
Ga鄄DOTA鄄DG[12,13]由于摇68Ga半衰期只有68min,迅速衰变,80min以后放射性活度
Cu鄄DOTA鄄DG在肿瘤部位的摄取随着时间的延长而增加,符
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Fig.3摇PETimagesof摇64Cu鄄DOTA鄄DG1h(A—C)and3h(D—F)afterintraveniousinjection
(A,D)Transverseplane;(B,E)coronalplane;(C,F)sagittalplane.
合肿瘤代谢显像的规律;在3h时能够观测到肿瘤的摄取,符合延迟显像的要求,而且在小鼠的脑部
3摇结摇摇论
未见明显的放射性摄取.以上性质表明摇64Cu鄄DOTA鄄DG具有作为的PET显像剂的潜质.
95%,可用于PET显像的摇64Cu鄄DOTA鄄DG分子探针.制备的摇64Cu鄄DOTA鄄DG通过放射性药物质量控制并具有良好的体外稳定性.Micro鄄PET显像结果表明,集,且在肿瘤中的摄取随着时间的延长而增加.迟显像的新型PET分子探针.
64
64
了标记温度和标记时间对标记产率的影响.通过优化标记条件,获得了标记率和放化纯度均大于
Cu鄄DOTA鄄DG在小鼠脑部未见明显放射性浓
采用新型正电子核素摇64Cu对葡萄糖衍生物DOTA鄄DG进行放射性标记,用Radio鄄HPLC检测研究
Cu鄄DOTA鄄DG是一种潜在的可用于肿瘤代谢行为延
支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20130718.
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Radio鄄labelingandMicro鄄PETStudyof摇64CuLabeledD鄄GlucoseforTumorImaging覮
HONGYe1,2,ZHUHua1,HUJi2,LINXinfeng1,QINGJing2,YANGZhi1*
2.IsotopeDepartment,ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China)
PekingUniversityCancerHospital&Institute,Beijing100142,China;
(1.KeyLaboratoryofCarcinogenesisandTranslationalResearchofMinistryofEducation,DepartmentofNuclearMedicine,
Abstract摇2鄄(4鄄Isothiocyanatobenzyl)鄄1,4,7,10鄄tetraazacyclo鄄dodecane鄄1,4,7,10鄄tetraaceticacid鄄D鄄glucose(pH=5.5)wasaddedtotheeluentof摇64Cu.Thesolutionwasstirredandplacedat25益for30min.Thela鄄
(DOTA鄄DG)wassynthesizedandradiolabeledwith摇64Cu.TheDOTA鄄DGdissolvedinsodiumacetatebufferbelingefficiencyandradiochemicalpurityof摇64Cu鄄DOTA鄄DGwereallover95%,asdeterminedbyradio鄄HPLC.Theinvitrostabilityoftheconjugateswasanalyzedin0郾1mol/LPBSand0郾1mol/LNaAcanditshowedexcellentinvitrostability.14.8MBqof摇64Cu鄄DOTA鄄DGwasinjectedtoHep鄄G2xenograftmodelsviatalevein.Positronemissiontomographyimagesweretaken1and3haftertheinjection.Theseimagessugges鄄provideimagesmuchclearerthantheDGlabeledwithging.
99m
tedthattherewashightumoruptakeof摇64Cu鄄DOTA鄄DG.Theresultssuggestedthat摇64Cu鄄DOTA鄄DGcouldlismofDGmuchlonger.Thesepreliminarydatashowthat摇64Cu鄄DOTA鄄DGappearstobeusefulinPETima鄄Keywords摇2鄄Amino鄄deoxy鄄D鄄glucose;摇64Cu;Positronemissiontomography(PET);Tumor
(Ed.:P,N,V,K)
Tc,
111
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ScienceFoundation,China(No.7132040).
覮SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.81071198,81172082,81371592)andtheBeijingMunicipalNatural
[支持信息]
Fig.S1 HPLC analysis of DOTA-DG reaction system
Radio-HPLC分析条件：淋洗梯度:流动相(A:含有0.1%三氟乙酸的H2O B:含有0.1%三氟乙酸的乙腈) 0~10 min, 0~10% 流动相B; 10~12min, 10%~50% 流动相B; 12~20%, 50%~80% 流动相B; 20~22 min, 80%~10% 流动相B; 流速1.0mL/min, 双通道检测器串联通道1.紫外检测器设定为280nm (UV)和通道2. 放射性检测器 (Radio)
Fig.S2 Radio-HPLC analysis of 64Cu-DOTA-DG
Gradient a: V(A):V(B)=90:10;b:V(A):V(B)=50:50;c:V(A):V(B)=30:70.
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