鸡组织中马杜霉素残留的高效液相色谱法测定

鸡组织中马杜霉素残留的高效液相色谱法测定

吴荔琴,方炳虎,肖田安,邓国东

1,2

2

1

1

(1.广东省兽药与饲料监察总所,广州󰀁510230;2.华南农业大学兽医学院,广州󰀁510642)

[收稿日期]2009-09-27󰀁[文献标识码]A󰀁[文章编号]1002-1280(2010)07-0019-04󰀁[中图分类号]S859.84

[摘󰀁要]󰀁建立了鸡组织(肌肉、肝脏、皮肤/脂肪)中马杜霉素残留的高效液相色谱荧光检测法。肌肉、肝脏样品经异辛烷提取,皮肤/脂肪样品经乙腈提取,Florisil固相萃取柱净化,丹磺酰肼衍生后上机测定。采用SupelcoC18色谱柱分离,以乙腈-7mmol/L硫酸氢化四丁胺溶液(85󰀂15,

V/V)为流动相,荧光检测器检测,激发波长为260nm,发射波长为510nm。结果显示,在0.15~7.2󰀁g/mL浓度范围内,线性关系良好;组织添加回收率均大于70%,定量限为0.03mg/kg。[关键词]󰀁马杜霉素;高效液相色谱法;残留;鸡

DeterminationofMaduramicinResidueinChickenTissuesbyHPLC

WULi-qin,FANGBing-hu,XIAOTian-an,DENGGuo-dong

(1.GuangdongInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuffsControl,Guangzhou510230;2.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642;China)

1,2

2

1

1

Abstract:Anhigh-performanceliquidchromatographymethodwithfluorescencedetectionwasdevelopedtodeterminetheresiduesofmaduramicininchickentissues.Thesamplesofmuscleandliverwereextractedbyisooctanerespectively,andthesamplesofskinwithfatwereextractedbyacetonitrile,cleanedbyaflorisilcolumnsolidphaseextraction(SPE),andderivatizedbydansylhydrazine.TheseparationwasperformedonSupelcoC18withamobilephaseofacetonitrile/watermodifiedwith7mmol/Ltetrabutylammoniumhydrogensulfate(85󰀂15,V/V).Fluorescencedetectionwasperformedatanexcitationwavelengthof260nm,andanemissionwavelenghthof510nm.Itwasshowntha,tthestandardcurvesformaduramicinwereingoodlinearityinaconcentrationrangof0.15~7.2󰀁g/mL.Therecoveriesformaduramicinattheadditionofthreelevelsinchickentissuesweremorethan70%.Thelimitofquantification(LOQ)was0.03mg/kg.Keywords:maduramicin;HPLC;residue;chicken󰀁󰀁马杜霉素又名马杜米星,是目前药效最强的聚醚类离子载体抗生素,因其价格合适,常作为药物添加剂被广泛使用

[1]

人血管舒张,特别是诱发心脏冠状动脉扩张和血流量增加,对患有冠状动脉疾病的人群,可引起冠状动脉扩张,病情恶化。因此在动物性食品残留分析中,马杜霉素成为重要的监控对象。

目前,马杜霉素残留的检测方法有ELISA和LC-MS/MS

[4-5]

[3]

。由于鸡不断食入球虫卵,因

此在鸡的整个生长期需要不间断给药防控球虫病,这种用药方式易导致动物性食品中的药物残留。随着给药浓度的增加,马杜霉素在组织中的残留浓度也增加

[2]

法

法,但ELISA法假阳性高,LC-

。食入残留有马杜霉素的食物可引起MS/MS法需要昂贵仪器,不利于推广。本研究拟

作者简介:吴荔琴(1980年-),女,广西荔浦人,硕士,从事兽药残留检测及其方法的研究。E-mai:lwuliqin2009@126.com通讯作者:肖田安。

20

[6-7]

󰀁中国兽药杂志󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁2010,44(7):19~22/吴荔琴,等󰀁

在Gliddon等建立的饲料中马杜霉素HPLC-FLD方法的基础上,通过优化提取、净化、衍生及色谱分离条件,提高方法的灵敏度,建立了符合残留检测要求、可推广的马杜霉素在鸡组织中残留的高效液相荧光检测法。1󰀁材料与方法1.1󰀁试剂与仪器

1.1.1󰀁试剂与标准品󰀁色谱级乙腈购自德国Merck公司;分析纯乙腈,天津市福晨化学试剂厂;异辛烷,天津市大茂化学试剂厂;二氯甲烷、冰醋酸、甲醇、正丙醇,广州化学试剂厂;丹磺酰肼纯度!95%,美国fluka公司;硫酸氢化四丁胺纯度>98%,美国Acros公司;超纯水由Milli-Q纯水系统制备,美国Millipore公司提供;马杜霉素对照品,批号K0181203,含量93.7%,来自中国兽医药品监察所;SPE柱,酸性氧化铝柱,500mg/3mL。1.1.2󰀁仪器与设备󰀁高效液相色谱仪,Aglient1100型,配FLD检测器,美国Aglient公司;超速离心机,德国Eppendorf公司;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;负压固相萃取装置,美国J.T.Baker公司;氮吹仪,广州市正一科技有限公司。1.2󰀁标准溶液的配制

1.2.1󰀁标准储备液(1000󰀁g/mL)󰀁准确称取50mg马杜霉素对照品于50mL容量瓶,用乙腈溶解制成1000󰀁g/mL的标准储备液。-20∀保存3个月。

1.2.2󰀁标准使用液(100󰀁g/mL)󰀁准确量取标准储备液5.0mL于50mL容量瓶,用乙腈稀释至刻度,制成100󰀁g/mL的标准使用液。4∀保存1个月。

1.2.3󰀁标准工作液(10󰀁g/mL)󰀁准确量标准使用液5.0mL于50mL容量瓶,用乙腈稀释至刻度,制成10󰀁g/mL的标准工作液。4∀保存两周。1.3󰀁测定方法1.3.1󰀁色谱条件󰀁色谱柱为supelcoC18柱(150mm#4.6mm,5󰀁m);流动相为乙腈-7mmol/L硫酸氢化四丁胺(85󰀂15,V/V)组成;流速为1mL/min;荧光检测激发波长为260nm,发射波长为510nm;进样量为20󰀁L;柱温为30∀。1.3.2󰀁提取󰀁󰀁肌肉、肝脏:准确称取匀浆组织(5.00∃0.05)g于50mL离心管,加10mL水(肝脏加5mL),混匀,加15mL异辛烷,中速水平摇振15min,6000r/min离心10min,取上清转入梨形瓶,残渣用15mL异辛烷重复提取1次,合并提取

液,在(40∃2)∀水浴锅旋转蒸发至干。

皮肤/脂肪:准确称取匀浆组织(5.00∃0.05)g于50mL离心管,加5g无水硫酸钠,混匀,加15mL乙腈,中速水平摇振15min,6000r/min离心10min,取上清转入梨形瓶,残渣用15mL乙腈重复提取1次,合并提取液,加正丙醇5mL,在(40∃2)∀水浴锅旋转蒸发至干。

1.3.3󰀁净化󰀁用5mL异辛烷分两次溶解梨形瓶中的残留物,加入预先用6mL异辛烷活化的固相萃取小柱,再用3mL二氯甲烷淋洗,最后用6mL甲醇二氯甲烷(1󰀂9,V/V)溶液洗脱,收集的洗脱液于玻璃试管中,于50∀下氮气流吹干,加入2mL乙腈涡旋混匀后,超声溶解5min,待衍生化。1.3.4󰀁衍生󰀁取1mL待衍生化样品液置具塞试管中,加入0.05mL冰醋酸,轻微混匀,再加入0.7mL0.75%丹磺酰肼溶液,轻微混匀后盖上试管塞,置于50∀恒温箱中反应10min,取出置60∀下用氮气流吹干,残留物用0.5mL乙腈溶解,过0.45󰀁m的滤膜后用于HPLC分析。

1.4󰀁添加回收率与精密度测定󰀁准确称取匀浆空白组织,添加马杜霉素标准使用液适量使之成为1/2MRL、MRL、2MRL三个浓度水平。(根据农业部235号公告,肌肉中的马杜霉素最高残留限量MRL为0.24mg/kg,肝脏中为0.72mg/kg,皮肤/脂肪中为0.48mg/kg)。按提取、净化、衍生步骤操作测定,每个浓度做5个重复,共做4批,根据测得的峰面积计算回收率及其批内、批间变异系数。2󰀁结果2.1󰀁标准曲线󰀁在浓度为0.15~7.2󰀁g/mL范围内,马杜霉素标准溶液的色谱峰与浓度呈良好的线性相关,回归方程为:y=0.0297x-0.0097,r!0.999。2.2󰀁回收率与精密度󰀁在1/2MRL、MRL、2MRL三个添加浓度水平,对鸡组织进行添加回收试验,结果见表1。2.3󰀁色谱图󰀁马杜霉素标准品溶液、空白组织及空白添加组织的色谱图见图1~3。3󰀁讨论

3.1󰀁流动相󰀁马杜霉素在化学结构上含有多个醚基和一个一元有机酸基,属于酸性物质,容易形成阴离子,可与硫酸氢化四丁胺中的阳离子N结合形成类似%中性&的离子,阻止药物离子与色谱柱中+

󰀁2010,44(7):19~22/吴荔琴,等󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁中国兽药杂志 21

的填料键和,避免色谱峰出现脱尾现象,从而改善

[8]

峰形和分离度。故选择硫酸氢化四丁胺作为离子对试剂。

3.2󰀁衍生方法󰀁在衍生过程需要注意以下两方面。其一,丹磺酰肼遇热、酸不稳定,衍生后需立即

吹干衍生产物,避免酸在衍生产物中的残留,并放

置于干燥阴凉处,防止因温度高或酸的存在导致衍生产物的分解。其二,衍生过程中,微量水份的存在会降低衍生化反应的产率,因此衍生反应一定要在干燥的环境中完成。

表1󰀁鸡组织中马杜霉素的添加回收率试验结果

样品/批次

添加浓度/(mg kg-1)

0.12

肌肉

0.240.48

肝脏

0.360.721.440.24

皮肤/脂肪

0.480.96

回收率/%

181.3(7.4)82.9(4.6)87.4(4.7)83.5(3.1)

85.7(7.0)83.4(5.0)84.8(9.8)83.6(8.7)85.5(5.8)

281.9(7.4)86.6(5.2)91.3(5.3)86.9(7.0)

83.7(6.7)85.1(5.6)84.8(6.1)84.3(4.5)80.3(8.2)

385.5(6.3)84.5(5.8)86.2(5.2)80.9(2.81)

85.6(3.0)81.1(3.1)85.2(9.5)83.4(7.6)83.2(8.3)

487.5(5.9)89.3(4.6)89.0(5.0)84.1(5.0)

88.7(5.0)86.0(4.4)84.2(7.2)81.1(9.6)80.8(7.2)

平均回收率/%(n=20)

84.1(6.9)85.8(5.5)88.5(4.8)83.9(5.1)

85.9(5.0)83.9(4.7)84.8(5.0)83.1(4.5)82.5(5.9)

󰀁注:括号内的数字为RSD/%

22 󰀁中国兽药杂志󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁2010,44(7):19~22/吴荔琴,等󰀁

A.马杜霉素标准品溶液(2.4mg/L);B.空白皮肤/脂肪;C.空白皮肤/脂肪添加马杜霉素(0.48mg/kg)

图3󰀁皮肤/脂肪中马杜霉素的色谱图

3.3󰀁提取剂的选择󰀁马杜霉素极性低,可用多种有机溶剂提取。异辛烷提取回收率最高,对亲水性样品基质溶解性不强,不会出现脂肪酸等极性低的易对马杜霉素衍生化检测产生干扰的杂质,有助于减少净化的压力

[8]

谱条件下,莫能菌素会出现药物峰,但出峰时间(7.6min)较马杜霉素药物峰(11.7min)早4min,不会干扰马杜霉素的测定。故莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素都不会干扰马杜霉素的测定。参考文献:

[1]󰀁苏帅,卜仕金.牛磺酸对马杜霉素中毒大鼠的保护作用[J].

中国兽药杂志,2009,43(7):16-19.

[2]󰀁沈建忠,钱传范,杨汉春,等.肉鸡组织中马杜霉素残留检测

的研究[J].畜牧兽医学报,1998,31(6):62-68.

[3]󰀁沈建忠,钱传范,杨汉春,等.马杜霉素在鸡组织中残留检测

方法的研究[J].畜牧兽医学报,1999,30(2):172-179.[4]󰀁StevenJS,JinnW,AdrianR,etal.Maduramicin󰀂:Charac󰀁

terizationof14C-DerivedResiduesinTurkeyExcreta[J].JAg󰀁ric.FoodChen,1991,39:386-391.

[5]󰀁DuboisM,PierretG,DelahautPh.EfficientandSensitiveDetec󰀁

tionofResiduesofNineCoccidiostatsinEggandMusclebyLiq󰀁uidChromatography–ElectrosprayTandemMassSpectrometry[J].JournalofChromatographyB,2004,813:181-189.[6]󰀁GliddonMJ,WrightD,MarkantonatosA,etal.Determinationof

MaduramicinAmmoniuminPoultryFeedstuffsbyHigh-Perform󰀁anceLiquidChromatography[J].Analyst,816.

[7]󰀁MarkantonatosA.DerivatizationandHPLC/FlourescenceQuanti󰀁

tationofMaduramicinAmmoniuminFeedandPremixesatLevelsDownto5󰀁g/g[J].JournalofLiquidChromatography,1988,11(4):877-890.

[8]󰀁李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学

技术出版社,2002:553,561-562.

1988,113:813-

。因此选择异辛烷作为提取肌

肉和肝脏组织中马杜霉素的提取剂。但皮肤/脂肪组织中的脂肪含量高,异辛烷、乙酸乙酯的极性低,提取液中脂肪含量大,故采用乙腈作为皮肤/脂肪组织的提取剂。

3.4󰀁其他聚醚类药物的干扰󰀁马杜霉素等含有半缩醛或羰基结构的聚醚类药物都可以在酸性环境下,与丹磺酰肼进行成脎反应,生成具有强荧光的腙衍生物

[7]

。经试验证明,莫能菌素对照品的色谱

图(见图4)上出现了药物峰,而盐霉素、甲基盐霉素对照品的色谱图上均未出现了药物峰。因为莫能菌素的E环上有半缩醛,在酸性条件下生成醛基,与丹磺酰肼反应。而盐霉素、甲基盐霉素没有半缩醛或羰基结构,故不能与丹磺酰肼反应生成具有荧光效应的腙衍生物。虽然在相同的衍生和色

图4󰀁莫能菌素标准品溶液的色谱图