高效液相色谱荧光检测法检测鸡肉中甲砜霉素残留

高效液相色谱荧光检测法检测鸡肉中甲砜霉素残留

谢恺舟,徐东,陈书琴,谢星,黄玉萍,贾龙飞,郭辉生,王金玉

(1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室,

江苏扬州󰀁225009;2.扬州大学兽医学院,江苏扬州󰀁225009)

摘要:研究建立了用高效液相色谱荧光法检测鸡肉中甲砜霉素残留的方法。鸡肉经丙酮、二氯甲烷提取,饱和正己烷脱脂,氮吹仪吹干浓缩后,以乙腈―磷酸二氢钠溶液(0.01mol/L,含0.005mol/L十二烷基硫酸钠和0.1%三乙胺)(32󰀁68,V/V)为流动相,流速为1.0mL/min,荧光检测激发波长为225nm,发射波长为290nm。甲砜霉素在0.01~1.75mg/L浓度范围内,本方法线性关系良好,相关系数为0.9991。当甲砜霉素添加水平为5~500󰀁g/kg时,该方法平均回收率为79.49%~89.71%,相对标准偏差为4.96%~9.61%;日内相对标准偏差为5.68%~7.47%;日间相对标准偏差为8.89%~11.32%。甲砜霉素检测限为1.5󰀁g/kg(S/N=3),定量限5󰀁g/kg(S/N=10)。所建立的方法简便、快速、灵敏度高,适用于鸡肉中甲砜霉素残留的高灵敏度检测。

关键词:高效液相色谱;荧光检测法;甲砜霉素;鸡肉;残留

中图分类号:S859.84󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文章编号:1671󰀁7236(2011)03󰀁0163󰀁04

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󰀁󰀁甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)作为氯霉素的替代药物,是新型氯霉素类广谱抗菌药物,其结构与氯霉素类似,药理活性也类似,具有广谱抗菌能力,因其极佳的治疗效果已在畜牧业中得到广泛应用。甲砜霉素与氯霉素相比缺少对位硝基,不会诱导再生障碍性贫血,但可抑制红细胞、白细胞和血小板生成,程度比氯霉素轻,甲砜霉素还具有较强的免疫抑制作用,比氯霉素约强6倍,因此禁用于疫苗免疫期间。通过繁殖毒性试验结果表明,甲砜霉素具有胚胎毒性,用药后还会出现厌食、腹泻等不良反应。现除中国与日本外,在欧共体国家和美国甲砜霉素均禁用于食品动物。甲砜霉素在动物体内以原形残留,是动物组织中的残留标示物。欧盟药品评审管理局(EMEA)规定动物组织中甲砜霉素最高残留限量(MRLs)为0.05mg/kg;日本和韩国规定动物组织中甲砜霉素不能超过0.05mg/kg。中国也颁布了甲砜霉素在动物可食性组织中的MRLs,规定甲砜霉素在各种可食性动物组织的MRL不得超过50󰀁g/kg(中华人民共和国农业部,2002)。

目前,国内外对甲砜霉素的残留检测方法虽有报道(占春瑞等,2008;彭涛等,2005;蔡欣欣等,

收稿日期:2010󰀁09󰀁24

作者简介:谢恺舟(1964-),男,江苏人,副教授,博士,研究方

向:畜产品品质与安全。

基金项目:国家肉鸡产业技术体系资助(nycytx󰀁42G1󰀁05);江苏

省高新技术计划项目(BG2005307);江苏省科技成果转化专项(BA2008071)。2009;谢文等,2006;Chou等,2009;Li等,2006;Luo等,2010;Shen等,2009,2010;Zhang等,2008),但用高效液相色谱荧光检测法检测鸡肉中甲砜霉素残留的方法尚未见报道。因此,本试验建立了检测鸡肉中甲砜霉素残留的高效液相色谱荧光检测法(HPLC󰀁FLD),该方法简便、快速、灵敏度高,完全可满足检测鸡肉中甲砜霉素残留的要求。1󰀁材料与方法

1.1󰀁主要仪器󰀁高效液相色谱仪(美国Waters公司,配备两台515型泵、2475型荧光检测器和色谱工作站);电子分析天平:Ax205(瑞士MettlerTo󰀁ledo公司);高速冷冻离心机:D󰀁37520(德国Os󰀁terodeamHarz公司);氮吹仪:5085型(美国Orga󰀁nomationAssociates公司);超声波清洗器:KQ󰀁300DE型(昆山市超声仪器有限公司);漩涡混合器:G560E型(美国ScientificIndustries有限公司);超纯水制备仪:Purelaboption(英国ELGA公司);pH计,DELTA320(梅特勒―托利多仪器(上海)有限公司)等。

1.2󰀁药品及试剂配制󰀁甲砜霉素标准品:纯度100.0%,某兽医药品监察所,批号K0240706;甲砜霉素原粉:纯度95.9%,武汉某公司;乙腈:色谱纯,德国Merck公司;其他试剂均为分析纯;试验用水为PURELABUltra超纯水。甲砜霉素标准储备液:准确称取甲砜霉素6.3mg于10mL棕色容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配成630mg/L的甲砜霉素标准储备液,密封,-20󰀁保存。磷酸钠󰀁164󰀁疾病防治中国畜牧兽医󰀁2011年第38卷第3期

缓冲液(pH7.0):分别配制0.2mol/LNaH2PO4和Na2HPO4溶液,按39󰀁61混合即成。流动相:由A、B两种溶液按适当比例混合而成。A为色谱纯乙腈溶液;B为NaH2PO4溶液(0.01mol/L,其中含0.005mol/L十二烷基硫酸钠和0.1%三乙胺),用85%磷酸调pH至4.5。

1.3󰀁色谱条件󰀁色谱柱:HederaC18,5󰀁m,250mm󰀁4.6mmi.d.;流动相:乙腈󰀁NaH2PO4溶液=32󰀁68(V/V),用85%H3PO4调pH至4.5;检测器:荧光检测器,激发波长225nm,发射波长290nm;流速:1.0mL/min;进样体积:200󰀁L;柱温:30󰀁。1.4󰀁样品的提取与净化󰀁从低温冰箱中取出鸡肉,室温下自然解冻。用试样粉碎机打碎,制成肉糜,准确称取1.0g肉糜状样品于15mL聚丙烯离心管中,加入1mL磷酸钠缓冲液(pH7.0)置漩涡混合器上混匀,加入4mL丙酮,漩涡混合器上混合振荡2min,超声波振荡萃取20min,4000r/min离心15min,将溶液转移至另1支15mL离心管中,重复提取1次。合并2次上清液,并向溶液中加入5mLCH2Cl2,漩涡振荡混合2min,4000r/min离心10min,弃去上层水相,置50󰀁氮吹仪吹干,用1mL35%乙腈溶解残渣,漩涡振荡混匀1min,加入3mL正己烷(用35%乙腈饱和)漩涡混匀,4000r/min离心5min,弃去上层正己烷,水相转移至1.5mL离心管中,13400r/min离心15min,0.22󰀁m滤膜过滤,滤液上机进行HPLC检测。

1.5󰀁检测方法的考察1.5.1󰀁标准曲线、检测限及定量限󰀁用35%乙腈

分别将甲砜霉素标准储备液稀释成质量浓度为1.75、1.5、1.25、1.0、0.75、0.5、0.25、0.01mg/L的

系列标准工作液,进行HPLC分析。每个浓度重复测定3次,取平均值绘制色谱峰面积(A)―浓度(C)标准曲线。按1.4的方法制备空白鸡肉提取液,向其添加一定浓度的甲砜霉素标准溶液,进行HPLC分析,逐渐降低甲砜霉素的浓度,以样品检测的信噪比(S/N)为3和10的浓度分别作为检测限和定量限。

1.5.2󰀁样品回收率测定󰀁准确称取1.0g匀浆后的空白鸡肉,置50mL聚丙烯离心管中,添加不同浓度的标准工作液,使空白鸡肉中甲砜霉素添加量为:0.005、0.05、0.5mg/kg。每个添加量设6个平行,经1.4的方法提取和净化后,取200󰀁L进样做HPLC检测,以外标定量法计算添加回收率。1.5.3󰀁样品精密度的测定󰀁将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成3份,得到低、中、高3种药物浓度的样品,在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台HPLC重复测定低、中、高3种药物浓度的样品6次,求日内(批内)精密度;在1周内不同日用不同的标准曲线及同一台HPLC重复测定低、中、高3种药物浓度的样品6次,求日间(批间)精密度。2󰀁结果与分析

2.1󰀁色谱分离󰀁在本试验选定的色谱条件下,测得甲砜霉素保留时间约为4.70min,色谱峰峰形较佳,且为基线分离峰;空白鸡肉提取液在上述保留时间无干扰峰出现(图1)。

图1󰀁色谱图

注:A,TAP标准溶液(2000󰀁g/L);B,空白鸡肉样品;C,500󰀁g/kg添加样品;D,口服给药样品。

中国畜牧兽医󰀁2011年第38卷第3期疾病防治󰀁165󰀁

2.2󰀁标准曲线󰀁以甲砜霉素的色谱峰面积(A)对进样前甲砜霉素的质量浓度(C,mg/L)作图,得到其标准曲线,见图2。甲砜霉素的线性回归方程为C=0.0304A-0.0205,线性相关系数r=0.9991,线性范围0.01~1.75mg/L。

3.2󰀁流动相的优化󰀁本试验所使用的液相色谱仪配备2台美国Waters公司的515型泵,A泵泵入磷酸盐溶液,B泵泵入乙腈,通过调节两泵泵入流动相的比例,从而改变色谱柱极性和离子强度。当乙腈比例从20%调节到50%时,目标化合物的出峰时间提前且目标化合物峰与杂质峰部分重叠;当乙腈浓度为32%时,目标化合物峰与杂质峰完全分离,峰形较好。流动相中加入三乙胺可消除色谱柱填料表面硅羟基作用,改变甲砜霉素的峰形,减少峰拖尾现象。

3.3󰀁样品的提取与净化󰀁甲砜霉素微溶于水,溶于有机溶剂。目前国内外关于动物组织中甲砜霉素的

图2󰀁TAP标准曲线

提取方法有许多报道(占春瑞等,2008;彭涛等,2005;蔡欣欣等,2009;谢文等,2006;Chou等,2009;Li等,2006;Luo等,2010;Shen等,2009,2010;Zhang等,2008),提取剂一般为乙酸乙酯、乙腈、甲醇、丙酮等。本试验比较了不同的提取剂对回收率的影响。结果表明:甲醇提取效率较差,回收率较低;乙酸乙酯提取效率相对较高,但同时也带进了许多内源性物质,净化过程较为复杂;而采用丙酮和二氯甲烷作为提取溶液,提取效果好,回收率相对较高,而且带进的内源性物质少,不需要经过复杂的样品净化过程,简化了样品前处理步骤。

3.4󰀁标准系列溶液的设置󰀁目前绝大多数试验采用的标准系列是5个浓度的标准溶液,且这些浓度系列并不是等精密度测定,即低浓度的精密度高于高浓度的精密度,测定结果误差大。本试验采用标准系列浓度为1.75、1.5、1.25、1.0、0.75、0.5、0.25、0.01mg/L,共8个标准点比较定量,且这些浓度系列是等精密度测定,即低浓度的精密度等于高浓度的精密度,测定结果误差小。与GB/T1.1󰀁2009新版󰀁标准化工作导则󰀁培训教材中兽药残留标准制定的要求相一致。4󰀁小结

本试验在空白鸡肉中添加不同浓度的甲砜霉素标准工作液,测得鸡肉中甲砜霉素平均回收率均在79.49%以上,符合AOAC残留测定要求。本试验建立的检测方法灵敏、简便、快速、易行,可满足鸡肉样品中甲砜霉素残留检测的要求,对实施从农田到餐桌的农产品质量控制管理措施,破解技术壁垒,防止TAP含量超标的鸡肉产品进入食物链具有重要意义。2.3󰀁样品回收率及精密度󰀁鸡肉中TAP的添加回收率及精密度见表1。由表1可知,当甲砜霉素添加水平为5~500󰀁g/kg时,该方法平均回收率为79.49%~89.71%,相对标准偏差(RSD)为4.96%~9.61%。日内相对标准偏差为5.68%~7.47%;日间相对标准偏差为8.89%~11.32%。结果表明:该检测方法可靠,重复性好。

表1󰀁鸡肉中TAP的添加回收率及精密度

添加浓度(󰀁g/kg)

550500

平均回收率

(%)79.4981.8589.71

RSD(%)9.618.744.96

日内RSD(%)7.477.155.68

日间RSD(%)11.328.899.68

2.4󰀁灵敏度󰀁应用本试验建立的检测方法,测得鸡肉样品中甲砜霉素的检测限为1.5󰀁g/kg(S/N=3),定量限为5󰀁g/kg(S/N=10),表明该方法灵敏度高,完全能满足甲砜霉素在鸡肉中残留检测的需要。3󰀁讨论

3.1󰀁检测器及检测波长的选择󰀁本试验采用美国Waters公司2475型荧光检测器检测,在激发波长225nm时,分别在发射波长280、285、290、295、300nm检测同一样品,对其检测灵敏度进行比较,最终确定发射波长为290nm。在激发波长225nm,发射波长290nm检测与紫外检测器检测(󰀁=225nm)相比,不仅样品杂质峰少,干扰少,能把甲砜霉素与样品中其他组分完全分开,而且荧光检测器检测灵敏度比紫外检测器灵敏度高2~3个数量级,更有利于甲砜霉素药物残留的检测。󰀁166󰀁疾病防治中国畜牧兽医󰀁2011年第38卷第3期

phenicol,thiamphenicolandflorfenicolresiduesinanimaltissues

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JIALong󰀁fei,GUOHui󰀁sheng,WANGJin󰀁yu

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(1.KeyLaboratoryforAnimalGenetic,Breeding,ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince,CollegeofAnimal

ScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,

YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Abstract:Ahighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetection(HPLC󰀁FLD)methodwasbuiltfordeter󰀁minationofresiduesofthiamphenicol(TAP)inchickenmuscle.TAPwasextractedwithacetoneanddichloromethanefromchickenmuscle.Extractsolutionwasdegreasedwithn󰀁hexaneandevaporatedwithnitrogenevaporator,themobilephasewasacetonitrile󰀁sodiumdihydrogenphosphatesolution(0.01mol/L,containing0.005mol/LSDSand0.1%triethylamine)(32󰀁68),theflowratewas1.0mL/min.Thefluorescencedetectionwaswithanexcitationwavelengthof225nmandanemissionwavelengthof290nm.ThedatashowedthatthelinearrelationshipofTAPwasnice(r=0.9991)in0.01mg/Lto1.75mg/Lconcentrationrange.Atspikedlevel5to500󰀁g/kgforTAP,theaveragerecoveryrangedfrom79.49%to89.71%,relativestandarddeviation(RSD)rangedfrom4.96%to9.61%,thewithin󰀁dayRSDrangedfrom5.68%to7.47%,thebetweendayRSDrangedfrom8.89%to11.32%.ThelowestdetectionlimitofTAPwas1.5󰀁g/kg(S/N=3)andthelowestquantitativelimitofTAPwas5󰀁g/kg(S/N=10).ThisHPLC󰀁FLDmethodissimple,rapid,highsensitivityandsuitableforhighsensitivi󰀁tydeterminationofTAPinchickenmuscle.

Keywords:highperformanceliquidchromatography(HPLC);fluorescencedetection;thiamphenicol(TAP);chickenmuscle;residues