优化HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件

Food Research And Development

食品研究与&发

2018年10月 第39卷第19期

DOI ： 10.3969/j.issn.l005-6521.2018.19.026

优化HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量

样品处理的条件

李艳4#2

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018:2.河北省发酵工程技术研究中心，

河北石家庄050018)

摘要：针对不同种类氨基酸采取不同水解方式，优化黑皮鸡枞菌的水解方法，利于高效液相色谱法（high

performance liquid chromatography，HPLC )测定样品不同部位'基酸的组成及含量。通过对黑皮鸡机菌进行酸水解、減 水解和过甲酸氧化法处理，并进行正交试验优化酸水解的条件，以2,4-二硝基氟苯(2,4-dinit2〇flu〇2〇benZene，DNFB) 为柱前衍生剂，反相高效液相色谱法检测黑皮鸡枞菌菌伞、菌柄及子实体中的氨基酸组成。结果表明：当HCl浓度 为6mol/L、加量4mL、110 !水解24h时可获得较优的水解效果。采用HPLC检测两个地区产的黑皮鸡枞菌子实体 和菌伞、菌柄中，L种水解方法结合处理的水解液，均检出21种氨基酸，总量分别为21.51%、23.68%;菌伞比菌

柄中氨基酸含量约高1.28倍。3种水解方法结合处理样品可更全面的检测黑皮鸡枞菌中的氨基酸。关键词！黑皮鸡枞菌;样品处理;氨基酸含量；高效液相色谱法

Optimization Conditions of Processed Sample for the Determination of

Amino Acid Content in Termitomyces spp. by HPLC

LIYan1’2

(1. College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China; 2. Hebei R&D Center for Fermentation Engineering，Shijiazhuang 050018，Hebei，

China)

Abstract ： Different hydrolysis methods for different kinds of amino acids were used and optimised in Termitomycesspp and that was better for the determination of the composition and content of amino acids in different parts of the sample by high performance liquid chromatography ( HPLC ). Acid hydrolysis, alkali hydrolysis and peroxy formic acid treatments were used in this study. And the orthogonal test was carried out to optimize the acid hydrolysis. With 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) as the pre-column derivatization reagent, reversed phase HPLC was used for determination the content and composition of amino acids in pileus, stipe and sporophore of Termitomycesspp The results showed that the optimal hydrolysis was obtained when the concentration of HCl was 6 mol/L, the adding dosage was 4 mL and hydrolysis at 110 ! for 24 h. Amino acids in pileus, stipe and sporophore of Termitomycesspp in two growing area was detected by HPLC combined with the three hydrolysis methods, and 21 kinds of amino acids were detected with 21.51 M and 23.68 M of the total, respectively. In the pileus, the amino acid content was about 1.28 times higher than that of stipe. Combined the sample with the three hydrolysis methods can be more comprehensive detection of the amino acids in Termitomycesspp..Key words： Termitomycesspp sample treatment; amino acids content; high performance liquid chromatog­raphy

. .. . .-基金项目:石家庄市科学技术研究与发展计划项目（161200491A)

作者简介:李艳(1958—)，女(汉)，教授，本科，研究方向:传统发酵工程创新技术研究、酒类酿造。

148 —

引文格式：

李艳：优化

HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件

标准与检测

LI Yan. Optimization Conditions of Processed Sample for the Determination of Amino Acid Content in Termitomycesspp by

HPLC[J].Food Research and Development,2018,39(19): 147-152

.

李艳.优化HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件[J].食品研究与开发,2018,39(19): 147-152

黑皮鸡纵菌(Termitomyces spp)属于担子菌纲，伞 菌目，侧耳科，鸡枞菌属，是珍贵的野生食用菌，全世界 约有25种，我国有19种，主要生长在云南、四川、贵州 等地[1]。自然界中鸡枞菌只能生长在白蚁巢穴上，白蚁 菌圃中含有丰富的氨基酸等营养活性物质[2-3]，与白蚁 共生的野生鸡枞菌同样营养丰富，尤其蛋白质的含量 较高，蛋白质中含有丰富的氨基酸，其中人体必需的8 种氨基酸种类齐全&4-5]。同时，与白蚁的复杂共生关系 使人工

的鸡枞菌与野生鸡枞菌在 的。

，鸡枞菌的人工

于

，究人

工栽培鸡枞菌中氨基酸的组对于评价人工 鸡

枞菌具有重要的指导意义。

氨基酸是鸡枞菌中重要的营养物质，目对食用 菌中氨基酸的

主要通过对样

酸 ，

氨基酸 [1-2气在酸性

中，HC1是用的 ，是酸

中同

的

坏半胱氨酸、丝氨酸

氨酸， 全 氨酸&7-]。

氨基酸 在

高，属性，

等问题对

[9-1。]。本研究

酸

[11]，

[12] 酸

，

[9(，对

地

的 皮鸡枞菌

进行水解处理，米用高效液相色谱法(high performance

liquid chromatography，HPLC)法测定和分析两个地区

皮鸡枞菌中同 的氨基酸组，

皮鸡枞

菌性

工的

基

。

1

材料与仪器

1.1 与试剂

新鲜黑皮鸡枞菌(,ermitomyces spp.):分别由河北

济食用菌有限公司

金珠满江农业有限公司

提供。将鸡枞菌子体的菌伞、菌柄分离后 切成

细状，置于鼓风干燥箱中55 !干燥至恒重，粉碎，过 40目筛，备用。

天门冬氨酸（Asp)、谷氨酸（Glu)、羟基脯氨酸 (Hyp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、 精氨酸（Arg)、甘氨酸（Gly)、苏氨酸（Thr)、脯氨酸 (Pro)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、胱氨 酸（Cys-S)、异亮氨酸（Ile)、亮氨酸（Leu)、色氨酸

(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)、 赖氨酸(Lys)和酪氨酸(Tyr):美国sigma公司，纯度 均！98 %;

级甲醇乙腈:湖北杜文化工科技有

限公司;2,4-二硝基氟苯:艾科学 公司；磷酸二

氢钾、无乙酸钠、冰乙酸、三乙胺、硼砂、硼酸、氢氧化

钠均 纯；

用

娃哈哈纯净水。

1.2 器

DWF-100型电动植物粉碎机:河北省黄骅县科研 机械厂；101-0AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰 器有限公司;Waters 2695高 有tersWa2695分离 ，2996型二 器 宇斯科技(上海)有限公司；Hypersil ODS2色谱柱(250 mmx 4.6mm，5!m) 器有限公司。2

方法

2.1主要溶液的配制

pH 9.0硼酸缓冲溶液:配制0.05 mol/L的硼砂溶液 和0.2 mol/L的硼酸溶，按照体积比4# 1混均。

pH 7.0磷酸缓冲溶液：称取1.7 g磷酸二氢钾固 体， 溶解，转人500 mL容量瓶中，加人72.75 mL的0.1 mol/L的氢氧化钠溶液， 后 。

衍生试剂的制 量 0.5 mL的2,4-二硝基 氟苯，用乙腈 至50mL。

氨基酸标品的制备:称取0.05 g氨基酸标品用pH 9.0硼酸缓冲溶液定容至10 mL， 5 mg/mL氨基酸标品母液。取氨基酸标品母液各0.5 mL于25 mL容量 瓶中，用pH 9.0硼酸缓冲溶液定容，得到100 !g/mL

氨基酸对照品混溶。

过甲酸溶液：将30 O的过氧化氢与88 O甲酸按 照体积 1 $9均匀混合，于 置1h后置于冰

水浴中冷却30 min，用时现配。2.2 样

对于同种类的氨基酸，试验中采用3种 方 法对其 ，其中酸

用于

氨基酸的

，

用于氨酸分析，

酸氧

用于氨酸测定。

2.2.1酸水解

GB/T 5009.124-2016 食

全国 食

标准与检测

李艳：优化

HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件

品中氨基酸的测定》中样品的处理方法，在以HC1浓 度(mol/L)、HCl加人量(mL)、水解温度(！）、水解时间 00为影响因素的最佳单因素试验数据基础上，设计

L(34)正交试验。因素水平表见表1。

表

1酸水解正交试验因素水平表

Table 1 Table of acid hydrolysis orthogonal test factor level

因素

水平

HC1(mol/L 浓度\"/ HC1加人 水解

水解 量/mL温度/!

时间/h

142100

20264110243

8

6

12028

2.2.2碱水解法

精确称取黑皮鸡枞菌粉25 mg(精确到0.000 1 g)， 置于10mL水解管内，加人5m〇1/LNaOH溶液6mL， 氮吹仪吹氮气15 min后迅速封管;放入烘箱中110 ! 水解24 (;将水解后样品从水解管中转入蒸发皿中，并 用水多次洗水解瓶，洗液一并转入蒸发皿，80!水 浴蒸干；用皿，洗液转人50 mL容量瓶中，容;用0.45 !m ，用。

2.2.3过甲酸氧化法

甲酸氧化法借鉴于淑新等在高液

-柱

前衍生化法测定 中的 基酸中应用的方法[9]。2.3

基酸 法用2，4? 基

为柱前衍生试剂。取0.5 mL

氨基酸

溶液至5

mL

量瓶中，

加入NaHCO*缓冲溶液和2,4?二硝基 0.5 mL，放人60!水浴中，暗处反应60 min。取出后避光冷却 至室温，用pH 7.0 酸 溶液定 5.0 mL，置 15 min，取10 !L进样分析[13A。

2.4

色谱柱：Hypersil ODS2 色谱柱 250 mmx4.6 mm， 5 !m;流动相A 取3.56 g无水乙酸钠，溶于1 000 mL

水中，加人0.1 %三乙胺，用冰醋酸 pH 6.4。流动

相B : 50 %乙臆水;流速：1 mL/min;检测波长:360 nm;温:23!;样量：10!L;梯度洗 0~20min，30 %~36 % B;20 min~26 min，36 %~55 % B;26 min~ 41 min，55 %~65 %;41 min~46 min，65 %~90 % B; 46 min~48 min，90 %~98 % B;48 min~54 min，98 %~ 30 % B[13]。

2.5 数据 理

用仪器自带Waters-Empower软件。所

方

、

确性试验数据

Excel

149

2010计算得出。正交试验数据采用Minitab 15进行方

。

试验

3 平 。

3

结果与分析

3.1 基酸

取氨基酸对照品混标溶液，配制成10、20、50、80、

100!g/mL

基酸

液，水平

3次重复，以峰为 ，以 基酸浓度为方

，R2

于0.999，基酸

方见 2。

表

2氨基酸的标准曲线方程

Table 2 Thestandardcurveequationofaminoacids

号

基酸种类方

R21

天冬氨酸(Asp)y=l 925\"+17 906.60.999 92谷氨酸(Y1u)

y=l 006.5\"+7 005.80.999 93)基脯氨酸(Hyp)!=6 908.1\"+7 022.80.999 94天冬酰胺(Asn)y=l 839.9\"+9 324.30.999 95谷氨酰胺(Y1n)jw11 318.6\"+10 842.216丝氨酸(Ser)jw1 897.2\"-1 762.20.999 87精氨酸(Arg)!=13 895.4\"+44 748.70.999 98甘氨酸(Y1y)y=2 149.4\"-1 421.40.999 79苏氨酸(Thr)!=13 936.9\"+12 946110脯氨酸(Pro)y=l 317.8\"+8 443.70.999 911丙氨酸(A1a)7=12 125.5\"+12 749.10.999 912缬氨酸(Va1)7=9 021.2\"+11 168.70.999 913蛋氨酸(Met)

7=7 067.3\"+8 563.70.999 914胱氨酸(Cys-Cys)7=9 994.7\"+18 4280.999 915异亮氨酸(I1e)7=8 240.2\"+9 951.1116亮氨酸(Leu)7=7 618.8\"+78 597.20.999 717色氨酸(Trp)7=4 218.9\"+15 734.5118苯丙氨酸(Phe)

7=3 107.7\"+14 8080.999 919酸( His)7=8 038.8\"-51 928.4120半胱氨酸(Cys)7=7 754.6\"-46 1880.999 821赖氨酸(Lys)7=10 035.6\"-2.591 80.999 922

酪氨酸(Tyr)

7=4 736.9\"-5 479.6

0.999 2

3.2酸水解 化

按照2.2.1中的方法进行试验，正交试验结果和方

见 3

4。

表

3黑皮鸡枞菌酸水解正交试验结果

Table 3 Results of acid hydrolysis orthogonal test in

Termitomyces spp.

试验号

AQ HC1浓度/ HC1加人

水解水解

(mo1/L) 量/mL 温度/!

时间/h

结果/%

142100

2017.5244110 2419.1346

120 2817.8

----150

李艳：优化

HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件

表

标准与检测

3黑皮鸡枞菌酸水解正交试验结果

Continue table 3 Results of acid hydrolysis orthogonal test in

Termitomyces spp.

续表

4

黑皮鸡枞菌酸水解正交试验方差分析表

Table 4

o11'& 。付'）：）*#】1o3 #(0,

^ !ermit〇myces spp.

试验号

4

56789EiEK3R

*

HC1浓度/ (mol/L &66688819.53320.70019.1671.533

最优组合

HC1加人 水解 量/mL温度/!21104120610021204100611019.53319.50020.36720.10019.40019.7000.9670.600A2B2C2D2

水解 时间/h

结果/%

28202424282019.63320.10019.5670.533

19.220.118.818.118.218.1

HC1浓度/ HC1加人 水解 水解 (mo1/L &量/mL时间/h温度/!2222自由度

Seq SS6.000 333.243 31.390 00.243 3

3.001 71.621 70.695 00.121 7AdjMS

F31.2316.877.231.27!0.0000.0011.270:328S@0.310 018 R-Sq@92.64 %R-Sq(调整)=89.09 %

项目

5组并不是最优组合的结果，

按照正交试验中的最优组合，即HC1浓度为6 mol/L、 HC1加量为4 mL、*解温度110 !、*解时间24 (为 条件进行验证试验[14]，水解后氨基酸总量达20.5 %，因

此确定为试验的最优条件，后续对不同批次黑皮鸡枞 菌中的氨基酸含量进行测定时均采

条件。

最高，为20.1%。但是，第

由表3和表4可看出，所筛选的4个试验条件对 结果的影响因素大小为HC1浓度> HC1加人量> * 解温度> *解时间。其中HC1浓度和HC1加人量对于 结果有极显著影响，水解温度、水解时间对于试验结 果影响不显著。正交试验中最优组合为A2B2C2D2。正交 试验中第5组，即HC1浓度为6 mol/L、HCl加量为4 %L、 水解温度120 !、*解时间20 (时测得的氨基酸总量

表

3.3

黑皮鸡枞菌中氨基酸含量的测定

以优后的酸水解方案配合水解和过甲酸氧 ，对

县和北京两个产地栽培的黑皮鸡

品分为

、菌

枞菌中的氨基酸含量进行测定，伞和囷柄，结果见表5。

由表5可以看出，在两个地区所栽培的黑皮鸡枞

5不同地区黑皮鸡枞菌菌柄、菌伞和子实体中氨基酸含量及组成

Table 5 The content and composition of amino acids in pileus, stipe and sporophore of Termitomyces spp. in two different area

氨基酸种类赖氨酸（Lys)色氨酸（Top)组氨酸mm(Hqs)天冬酰胺（Asn)丝氨酸(Ser)精氨酸(Arg)脯氨酸(Pro)丙氨酸#(A1a)酪氨酸(Tyr)胱氨酸(Cys-Cys)半胱氨酸(Cys)缬氨酸（Va1)

县(二

菌

菌

%)

整菌

菌柄

京市（菌

％)

整菌

1e)亮氨酸（Leu)苯丙氨酸（Phe)苏氨酸（Thr)蛋氨酸（Met)氨酸 #( Asp)氨酸#(\\1u)

异亮氨酸（

1:120:304:270:070:370:60:521:271:050:520:220:750:520:371:950:750.071.202:701.320:295:080:150:590:740:591:251:030:520:220:880:660:664:860:960:071:252:871:320:234:540:150:290:590:591:170:880:510:220:730:590:443:510:880:071:242:781:220:245:360:080:410:490:490:980:980:490:240:730:570:413:170:73-1:382:681:570:395:750:080:470:630:631:101:020:630:240:940:710:795:831:020:161:572:831:340:405:060:080:470:550:551:111:030:630:240:870:630:634:190:870:081:422:69

标准与检测

李艳：优化

HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件

Continue table 5 The content and composition of amino acids in pileus, stipe and sporophore of Termitornyces spp. in two different area

河北省灵寿县(干.

風巷跋种失

续表5不同地区黑皮鸡枞菌菌柄、菌伞和子实体中氨基酸含量及组成

151

北京市(干重％)

菌伞

-------％)完整菌

菌柄

菌柄菌伞完整菌

9基脯氨酸(Hyp)谷氨酰胺(）

ln)

必需氣基酸总量(essential amino acid，EAA)非必需氣基酸总量(onessential amino acid，NEAA )鲜味氨基酸总量(flavor ammo acids，FAA)気基酸总量（total amino acid，TAA)

EAA/TAA(%)EAA/NEAA

注\\

表示人体（种必需氨基酸;

0.07

0.675.8313.535.1719.4030.050.430.070.749.7015.15.3724&8039.110&640&070.737&7713.765&1921&5136.120&560&080.737&0714.395&0421.4532.960.330&080&7911.4115&825&5027&2441&890&720&080&759&0114&665&2223.6838.050&61

”表示婴儿必需氨基酸;]”表示鲜味氨基酸;表示未检出

菌中均检测出除甘氨酸外21种氨基酸，邹立扣和施 渺筱[,分别对四川省和贵州省野生鸡枞菌进行氨基酸 测定，均含有甘氨酸，这可能是人工栽培黑皮鸡枞菌 与野生鸡枞菌存在的差异性。灵寿县栽培的黑皮鸡枞 菌氨基酸总量稍低于北京地区产品，分别为21.51 !和23.68 %， 分 相

6种食用菌中氨基酸与蛋白质进行了分析，其中姬松

中的氨基酸总量 ， 25.07 !，其次 ，氨基酸总量为15.96 !，云耳、银耳等其他4种 菌的氨基酸总量均在10!以下，远低于 测黑

皮鸡枞菌中氨基酸的总量，这充分

。

灵寿县和北京市人工栽培的黑皮鸡枞菌中粗蛋 白含量分别是35.33 !和42.13 !，氨基酸总量分别占

这两个地区人

工栽培的黑皮鸡枞菌氨基酸种类和含量丰富，营

存在地差异。黑皮鸡枞菌的不同部

氨基酸含量存在差异，菌伞中的氨基酸含量差

1.27左右，这与其他研究鸡枞菌氨基酸测定的结果

[1，11]。

测定的完整菌

干

的是 ， 是

菌的样品，

测定 种氨基酸含量 在菌伞 菌柄 中，菌

的赖氨酸、色氨酸氨酸 中的

差

的。

均高于菌柄，菌伞中氨基酸总量均出

伞、菌柄分，

5

氨基酸

的含量有差，是均 品

，这可能是于

21种氨基酸中，包含8种人必需氨基酸1种婴儿必

需氨基酸和3种鲜味氨基酸。8种人必需氨基酸的 总量分别为7.77 !和9.01 !，分别氨基酸总量的 36.12 !和38.05 ! 氨酸是 必需氨基酸，其含量 分别为4.54 !和5.06 !，达到氨基酸总量的21.11 ! 和21.37 %;3种鲜味氨基酸指谷氨酸、天冬氨酸和丙 氨酸，它们的总量分别为5.19 !和5.22 !，分别占氨 基酸总量的24.13 !和22.04 !。相对于已有报道的食

、

灵寿县和北京市栽培黑皮鸡枞菌中均检测的

56.21 !，必需氨基酸与总

氨基酸比值(essential amino acid/total amino acid，EAA/ TAA)分别为36.12%、38.05 %，必需氨基酸与非必需氨基酸比值（essential amino acid/nonessential amino acid，EAA/NEAA)分别为56 %和61 %，与联合国粮食 与农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FA〇)/ 世界卫生组织（World Health Organization，WHO )推荐的理想蛋白质模式EAA/TAA 40 S和EAA/NEAA为0.6接近[19]。因此，黑皮鸡枞

其粗

菌中氨基酸的模式与人 种适合人吸收的 中含量 氨酸和

氨酸，组氨酸在

需氨基酸模式相似，是一

源。测黑皮鸡枞菌内能自己合，

需

的氨基酸是氨酸、苯氨酸、谷氨酸

含量的60.88 !和

是婴儿必需氨基酸，苯氨酸和赖氨酸属于人 的特征氨基酸。的

研究

8种必需氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸是对鲜味有影响

此可以看出，黑皮鸡枞菌有

。

和开发

菌中氨基酸含量的检测结， 是含量 氨基酸 定 于

酸

的 其他

菌P'

氨基酸种类还

的[17测

与含量，

，黑皮鸡枞菌是一种有

KiangJaeLee 3种

检测黑皮鸡枞菌中的氨

主，氨基酸分

菌中的氨基酸

基酸，共检测出21种氨基酸，目前研究中对鸡枞菌氨 基酸的检测主要集中在以酸 仪检测，酸

能够全面检测出氨基酸的种类。

对品进行处理，均未检测

氨酸和胱氨酸，并且所测定食用菌中必需氨基酸的总 量均小于3 !，氨基酸总量均小于6 !

[18F对如施渺筱[4]在黔产鸡枞菌中检测出的氨基酸16种；

李艳：优化

HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件

标准与检测

152

张灵芝等在云南产鸡枞菌中检测出17种氨基酸;邹

立扣等[1$在四川省生长的10种鸡枞菌中检测出17种

氨基酸。因此，本试验所建立的鸡枞菌水解处理的方

法是可行可靠的。

4结论研究采用了酸水解法、碱水解法和过甲酸氧化法 分别对灵寿县和北京市栽培的新鲜黑皮鸡枞菌进行3

种方法水解，并对酸水解条件进行正交试优化，结果

显W在HC1浓度为6 mol/L、HCl加人量为4 mL、水解

温度110 !、水解时间24 3为水解条件时，能

的氨基酸含量。对3种方法水解的水解

2，4- 基氟苯作为柱前衍生剂进行HPLC法检测， 共测出21种氨基酸，北京市所产黑皮鸡枞菌氨基酸含 量稍于灵寿县，菌伞中氨基酸含量于菌中。黑

皮鸡枞菌氨基酸EAA/TAA、EAA/NEAA表明其蛋白质 于优 。通过3种水解方法结处理 可

的检测鸡枞菌中的氨基酸，为 对鸡枞菌

用菌氨基酸的研究 了理 。对

、菌伞和菌分别测对于 的进

行 加 产 。参考文献：

[1$邹立扣，潘欣，岳爱玲，等.四川省鸡揪菌氨基酸组成及硒元素含

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