3种山茶属植物花粉活力测定方法的比较

中南林业科技大学学报

JournalofCentralSouthUniversityofForestry&Technology

Vol.30 No.3 Mar.2010

3种山茶属植物花粉活力测定方法的比较

赵鸿杰1,乔龙巴图2,殷爱华1,薛克娜1,胡羡聪1,卢永梅1

(1.广东佛山市林业科学研究所,广东佛山528222;2.新疆乌苏市林业局,新疆乌苏833000)

摘 要: 采用I-IK法、过氧化物酶法和TTC法对张氏红山茶、越南抱茎、南山茶新鲜花粉的活力进行了测定。3种方法测定的结果表明:3种花粉活力都在92100%以上,南山茶的花粉活力最高,在90120%~100100%,越南抱茎茶次之在80180%~99140%,张氏红山茶在84180%~96100%。3种方法所测花粉活力存在显著差异或极显著差异。I-IK染色法所测花粉活力高于过氧化物酶法和TTC法所测花粉活力,此法染色快,并且染色清晰,可用于山茶花粉活力的快速测定;过氧化物酶法次之,TTC法所测花粉活力最小,这2种方法,染色需时长,而且染色不清晰,不适于快速测定山茶花花粉活力。

关键词: 植物生理学;张氏红山茶;越南抱茎茶;南山茶;花粉活力;染色法中图分类号:

Q945;Q949.758.4

文献标志码: A

文章编号: 1673-923X(2010)03-0105-03

Comparisonofdetectionmethodsforpollenviability

ofthreekindsofCamelliaplants

ZHAOHong-jie1,QIAOLONGBa-tu2,YINA-ihua1,XUEKe-na1,HUXian-cong1,LUYong-mei1

(1.FoshanInstituteofForestryScience,Foshan528222,Guangdong,China;

2.ForestryBureauofWusuCounty,Wusu833000,Xinjiang,China)

Abstract:ThepollenviabilityofCamelliabrevipetiolata,Camelliaamplexicaulis,Camelliasemiserratawerede-tectedbymethodsofiodine-iodidekalium(I-KI),triphenyltetrazoliumchloride(TTC)andperoxideenzyme(POD)coloration.ResultsshowthatpollenviabilityofCamelliasemiserratawasthehighest(97180%~100100%),thatofCamelliaamplexicaulisandCamelliabrevipetiolatawere80180%~99140%and84180%~96100%respective-ly.ItcanbeconcludedthatI-KImethodswasmorefavorablefordetectionthantheothertwobecauseitgothigherviabilityrateandcandyefastandclearly.Keywords:plantphysiology;viability;coloration

Camelliabrevipetiolata;

Camelliaamplexicaulis;

Camelliasemiserrata;pollen

张氏红山茶Camelliabrevipetiolata(又名杜鹃红山茶)、越南抱茎茶Camelliaamplexicaulis自被发现以来,就被科研人员和茶花爱好者所关注。张氏红

山茶叶形和花朵与杜鹃类似,叶片光亮碧绿边缘平滑;花单瓣,艳红色,密生枝顶,四季有花;不仅是我国的特有种,并且是最古老的山茶,一个极其珍稀的山茶品种,目前全世界仅在广东省阳春县鹅凰嶂省级

收稿日期:2009-08-06

自然保区分布,并且野生种不过千株。越南抱茎茶也四季开花,花瓣在硕大的雄蕊衬托下,更显艳丽;丰满的花蕾及宽大抱茎的叶片都有很高的观赏价值。张氏红山茶和越南抱茎茶株型紧凑,很适宜盆栽和园林绿化,并且花期长,叶型奇特,是培育新品种的优良亲本。南山茶Camelliasemiserrata主干明显,枝条微下垂,叶片宽大亮绿,花朵硕大,红色,病虫害

[1]

基金项目:广东省科技计划项目(2007B020813005);佛山市科技发展专项资金项目(200602005)

作者简介:赵鸿杰(1977-),女,内蒙古赤峰人,工程师,硕士,主要从事山茶花种质资源收集与城市林业研究

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赵鸿杰,等:3种山茶属植物花粉活力测定方法比较 第3期

少,也是园林绿化和作为抗性亲本的好材料[1]。花粉是开展杂交育种最基本也是最重要的材料,花粉活力的大小对育种成果影响很大,授粉前对花粉活力的检测是至关重要的。对山茶属植物花粉活力的测定鲜见报道,仅见王翔等对耐冬山茶的4个品种的花粉活力的研究和李天菲等[3]对不同贮藏条件下的杜鹃红山茶花粉生活力的研究。本文采用花粉活力测定方法[4-8]中的3种染色法对山茶属红山茶组的张氏红山茶和南山茶,古茶组的越南抱茎茶的新鲜花粉活力进行研究,旨在为利用3个山茶物种作育种亲本时提供理论参考依据,并确定快速准确测定山茶花花粉活力的染色方法。

[2]

015g碘待全部溶解后,再加蒸馏水至200mL,配好试剂后,贮于棕色瓶中备用。

载玻片上放少量花粉,然后加入1滴I-IK溶液,放置1~2min后,在低倍显微镜下观察。1.2.3 过氧化物酶测定法

具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶,此酶能利用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色,依据颜色可知花粉的活性强弱。

取015g联苯胺溶于100mL50%乙醇中,配成015%联苯胺溶液;015ga-萘酚溶于100mL50%乙醇中,配成015%a-萘酚溶液;取0125g碳酸钠溶于100mL蒸馏水中,配成0125%碳酸钠溶液;上述3种溶液各取10mL混合均匀配成试剂1,贮于棕色瓶中备用。

载玻片上放少量花粉,然后加试剂1和013%过氧化氢各1滴,搅匀后盖上玻片,放入30e恒温箱中30min后,在低倍显微镜下观察。花粉粒为深红色则表示有活力,能发芽;如无色,则表示已失去活力,不能发芽。

1.2.4 氯化三苯基四氮唑法(TTC法)

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的氧化状态是无色的,被氢还原时成红色的TTF。具有生命力的花粉,由于呼吸作用产生的氢能使TTC还原成TTF,因此花粉便染成红色;无生命的花粉没有呼吸代谢活力,TTC不被还原,因而花粉不着色。

用毛笔将花粉置于载玻片上,加1~2滴TTC溶液,盖上盖玻片放置于35e恒温箱中15min,然后在低倍显微镜下观察,凡染为红色的活力强,淡红的次之,无色者为没有活力的花粉或不育花粉。

3种方法每种花粉均制作3张玻片,即3个重复,每片取3个视野,每个视野统计100粒,并计算其发芽率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器1.1.1 供试材料

张氏红山茶为3年的嫁接苗,平均株高80cm,冠幅60cm,嫁接砧木是红山茶品种/红露珍0,地栽,生长良好;越南抱茎茶为4年生嫁接苗,平均株高60cm,冠幅45cm,嫁接砧木也是/红露珍0,为盆栽;南山茶为8年生实生苗,平均株高360cm,冠幅130cm,地栽。3个供试植物均保存于佛山市林业科学研究所。1.1.2 试 剂

碘、碘化钾、联苯胺、a-萘酚、碳酸钠、碳酸钠、过氧化氢、氯化三苯基四氮唑(TTC)、无水乙醇和蒸馏水。

1.1.3 仪器设备

电子天平、OLYMPUS显微镜、恒温箱、悬滴载玻片、盖玻片和镊子。1.2 方 法1.2.1 花粉收集

摘取3个物种的即将开放花朵,带回实验室后剪除花瓣,将花药放于硫酸纸上阴干,待花粉自然散出后,收集于棕色瓶中,贴上标签,备用。1.2.2 I-IK染色测定法

此法常用于鉴定不含淀粉的不育花粉,凡染成蓝紫色的为发育好、活力强的花粉,呈黄褐色的为发育不良的花粉。

取1g碘化钾溶于10mL蒸馏水中,然后加入

2 结果与分析

2.1 I-IK染色法

用I-IK染色法检测3种花粉活力,其由大到小的顺序是南山茶、越南抱茎茶、张氏红山茶,分别为100%、99140%和96100%。此法检测的花粉活力都很高,是因为I-IK染色法染色清晰,便于检测之故,可快速检测山茶属花粉活力。

第30卷 中南林业科技大学学报

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2.2 过氧化物酶法

过氧化物酶法测得花粉活力最高的是南山茶的花粉恬力为93140%,其次是张氏红山茶88140%,最小的是越南抱茎茶85100%。此法染色需时长,并且不清晰,难于观测计数,不适合快速检测花粉活力。2.3 TTC法

TTC法所测张氏红山茶、越南抱茎茶和南山茶分别为:84180%、80180%、90120%。TTC法操作繁琐,染色不明显,不易观测,这也是比其它方法所测花粉活力低的原因,也不适宜快速检测山茶属新鲜花粉活力。

3种不同染色方法,所检测花粉活力间有显著或极显著差异(见表1、表2)。对于张氏红山茶,越南抱茎茶和南山茶3种花粉,I-IK染色法与TTC法存在极显著差异,与过氧化物酶法存在显著差异,过氧化物酶法与TTC法存在显著差异。

表1 不同方法检测3种花粉活力方差分析Table1 Varianceandlysisofthreepollenviabilityby

differentdetectionmethods

变异来源自由度平方和均方F值P值(Pr>F)张氏红山茶2326193331631466730165<01001越南抱茎茶29261533346312667118179<01001南山茶2249173331241866757163<01001

间的花粉活力,还有待研究。

(2)-IIK染色法、过氧化物酶法和TTC法所测花

粉活力有显著差异。-IIK染色法比后2种方法测得的花粉活力高,过氧化物酶法和TTC法所测花粉活力差异不大。-IIK法染色快,并且染色清晰,但缺点是生活力弱的花粉也被染色,这是检测结果偏高的原因,在镜检计数时,注意区别染色深浅,可减少误差,此法对于快速检验花粉活力是不错的方法。过氧化物酶法和TTC法操作稍复杂,并且需时长,染色不清晰,在实际育种工作中,用于快速检测新鲜花粉活力不推荐使用这2种方法。

(3)3种花粉用过氧化物酶法检测,发现在30e放置30min后,并不染色,直到115h后才观察到有少量花粉染成红色,3h后才能计数。是否可以用升高温度或加大试剂浓度,来缩短反应时间,有待进一步研究。观察TTC法的花粉时看到,有活力的花粉呈三角状,并且至少1个角有气泡状物质,花粉粒附近有反应物。值得注意的是,张氏红山茶有活力的花粉都被染成了红色,而抱茎茶却没有被染成红色,但其花粉粒也呈三角状,附近有反应物。延长放置时间,再观察还是没有发现染成红色,在统计花粉活力时,就把呈三角状,至少有1个气泡状物质、附近又有反应物的计为有活力的花粉。也许这种方法值得商榷,并且为什么越南抱茎茶会出现这种情况,需做深入研究加以了解。参考文献:

南山茶

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较[J].浙江林学院学报,2006,23(4):406-409.

表2 不同方法检测3种花粉活力多重比较­

Table2 Multiplecomparisonofthreepollenviabilityby

differentdetectionmethods

张氏红山茶

染色法

越南抱茎茶

差异显差异显差异显

均值/%均值/%均值/%

著性著性著性

ABC

991408510080180

A

BC

1001009314090120

A

BC

I-IK染色法96100过氧化物酶法88140TTC法84180

差异不显著。

­检验的显著性水平为P=0105,不同字母表示差异显著,相同字母表示

3 结论与讨论

(1)张氏红山茶、越南抱茎茶和南山茶的新鲜花粉活力有差异,南山茶的花粉活力最高,为90120%~100100%,越南抱茎茶次之80180%~99140%%,张氏红山茶居后84180%~96100%。张氏红山茶和越南抱茎茶四季开花,对其花粉的收集贮藏是很有必要的。本文只测定了它们新鲜花粉的活力,对于不同成熟期的花粉以及不同贮藏时

[本文编校:吴 毅]