反相高效液相色谱法对猪肉组织中恩诺沙星和环丙沙星残留量检测的改进

２０１０年４月　第３１卷第４期　食品研究与开发　检测分析　反相高效液相色谱法对猪肉组织中　恩诺沙星和环丙沙星残留量检测的改进　孙焕，赵榕，牛晋阳，郭文萍　（中国肉类食品综合研究中心，北京１０００６８）　摘　要：利用配有荧光检测器的高效液相色谱同时分析动物组织中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的含量。研究结　果表明：环丙沙星、恩诺沙星的质量浓度在２　率为９２％～９９％。　￣１００　ｇ门Ｌ范围内呈线性关系，相关系数分别为０．９９９　３和０．９９９ｌ，该　方法中恩诺沙星和环丙沙星的最低定量限均为２　ｔｚｇ／ｋｇ（Ｓ／Ｎ＝１０），恩诺沙星的回收率为８５％一９０％，环丙沙星的回收　关键词：恩诺沙星；环丙沙星；高效液相色谱法；残留　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ａｎｄ　Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　Ｒｅｓｉｄｕｅ　ｉｎ　Ｐｏｒｋ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｂｙ　Ｒｅｖｅｒｓｅｄ　Ｐｈａｓｅ　ＨＰＬＣ　ＳＵＮ　Ｈｕａｎ，ＺＨＡＯ　Ｒｏｎｇ，ＮＩＵ　Ｊｉｎ—ｙａｎｇ，ＧＵＯ　Ｗｅｎ—ｐｉｎｇ　（Ｃｈｉｎａ　Ｍｅａｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００６８，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ａｎｄ　ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅｅ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｅｒｅ　ｋｅｐｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　２　ｇ／Ｌ一　１００￣ｇ／Ｌ，ｗｉｔｈ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　０．９９９　３　ａｎｄ　Ｏ．９９９　１　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ａｎｄ　ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｗｅｒｅ　ｂｏｔｈ　２　ｔｚｇ／ｋｇ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　８５％一９０％ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　９２％－９９％．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ；ｅｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ；ＨＰＬＣ；ｒｅｓｉｄｕｅｓ　作者简介：孙焕（１９８Ｏ一），男（汉），工程师，主要从事肉制品检测方面的研究。　●◆◆●¨●◆●ｌ●Ｉ●◆●●●●●◆◆●◆●●●●●◆●●◆●●●●●●◆◆●◆●●◆　●－ｒ●ｌＩ　收率（９８．７％～１０２．７％ｏ在芥末酱、芥末粉和芥末油等　食品中能很好地检出ＡＩＴＣ，他们的含量范围在０．３５　ｇ／Ｌ～　ｍｅｔｒｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｌｙｌ　ｉｓｏｔ　ｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｉｎ　ｂｌａｃｋ　ｍｕｓｔａｒｄ［Ｊ】．Ｔｈｅ　Ｆｌａｖｏｕｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ１９７ｌ（１　ｏ】：５９１—５９３　，，０．８６　ｇ／Ｌ之间，其中芥末油含量最高，达到０．８６　ｇ／Ｌ。　３小结　ｆ２］姜子涛，李荣．快速测定芥末油中ＩＴＣｓ的含量［Ｊ】．中国调味品，　１９９２（８）：２９—３０　［３】张清峰，姜子涛，张久春，等．紫外分光光度法测定辣根及芥末　制品中异硫氰酸酯含量的研究［Ｊ】．中国调味品，２００５（６）：１５—２０　［４］王建华，王宇，汗发文，等．关于辣根膏中“辣根油”检测方法的　探讨【Ｊ］．中国调味品，１９９７（１）：２６—２７　本研究在超声波辅助条件下，比较了不同有机溶　剂对异硫氰酸烯丙酯的萃取效果，结果表明甲醇对异　硫氰酸烯丙酯的萃取效果最好，萃取干扰性物质少，上　机检测分离效果满意，检测灵敏度和回收率均较高。　该方法操作简单、经济快速，能满足食品中对该物质的　检测分析要求。　参考文献：　…ｌ　Ｃｈｉｋｋａｐｕｔｔａｉａｈ　Ｋ　Ｓ，Ｓｈａｎｋａｍｎａｒ　ｙａｎａ　Ｍ　Ｌ，Ｎａｔａｒａｊａｎ　Ｃ　Ｐ．Ｖｏｌｕ－　［５１肖华志，牛丽影，廖小军，等．芥末油、青芥辣、冲菜的挥发性风　味成分的ＳＰＭＥ／ＧＣ／ＭＳ测定ｆＪ】＿中国调味品，２００４（６）：４２．Ｈ４５　ｆ６］孙莲，张丽静，符继红，等．ＧＣ—ＭＳ分析新疆芜菁子中挥发油的　化学成分［Ｊ】．华西药学杂志，２００７，２２（４）：３７４－３７５　收稿日期：２００９—１０—１６　检测分析　食品研究与开发　第３２０１１卷第４期　０年４月　恩诺沙星（Ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＥＮＲ）是一种常见的抑菌　和杀菌药物，化学名称为１一环丙基一６一氟一４一氧代一　１，４一二氢一７一（４一乙基一１一哌嗪基）一３一喹啉羧酸，环丙　沙星（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＣＩＰ）是其代谢产物，其抗菌活性　比ＥＮＲ更强，二者都是喹诺酮类药物（Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ，　ＱＮｓ）的第３代抗菌素。喹诺酮类是一类含有４一喹诺　酮母核的化学合成抗菌药，在肝、肺、肾等组织中浓度　为血中浓度的几倍，其作用机理是直接作用于细菌的　核，抑制细菌的ＤＮＡ旋转酶，从细菌核深处破坏细菌　的代谢和繁殖，迅速杀灭细菌。它具有吸收好、体内分　布广、半衰期长、抑菌和杀菌作用迅速、彻底，与其它　抗菌药物无交叉耐药性等优点，而广泛应用于动物和　人类的多种感染性疾病的预防和治疗『１＿。近年来，长期　以及不科学用药导致细菌的耐药性增强、药物残留超　标等问题相继出现，喹诺酮类药物残留问题越来越引　起人们的关注【２１，除其本身的毒副作用对人体造成直　接危害外，人类长期食用含较低浓度ＱＮｓ药物的动　物性食品，容易诱导耐药性的传递，从而影响该类药　物的临床疗效。更为严重的是残留在动物产品中的药　物对食用者的健康和生命安全都存在潜在的威胁。因　此，必须对这两种药物在动物产品中的残留问题予以　重视，以保证食用者的安全以及畜禽产品市场的健康　发展。　我国、联合国粮农组织／世界卫生组织食品添加剂　专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物　在动物组织中的最高残留限量。美国ＦＤＡ于２００５年　宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙　星的销售和使用【３ｌ，我国无公害禽肉及副产品规定恩　诺沙星、环丙沙星的最高残留限量为０．１０　ｍｇ／ｋｇ。为了　消费者健康，必须监控各种动物产品药物残留，为此需　要可靠的分析方法来监测这些药物残留。　我国现有的恩诺沙星和环丙沙星残留检测标准　是采用农业部第２３６号公告《动物源食品中恩诺沙星　和环丙沙星残留测定方法》，但此标准采用的前处理　方法繁琐，且回收率不高，本文采用酸化乙腈提取的　前处理方法，并对高效液相色谱条件进行优化，建立　最佳色谱条件，确保高效液相色谱分析测定时无样品　基质干扰，以及较高的回收率。使用荧光检测器进行　环丙沙星、恩诺沙星兽药残留量同时检测的研究。本　方法前处理过程简便、快速、安全，检测结果灵敏、可　靠，重复性好，回收率和检出限令人满意。适用于动物　组织中喹诺酮类药物残留的分析检测，可为动物源食　品中喹诺酮类药物的残留监控和监督检验提供技术　支持　９５　１材料与方法　１．１主要仪器　高效液相色谱仪：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００（配置荧光检测　器）；色谱柱：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　１００－５Ｃｌ８（２５０ｍｉｎｘ４．６ｍｍｘ５　ｍ）；　离心机：日本ＨＩＴＡＣＨＩ公司；Ｂ一２６０型恒温旋转蒸发　仪：上海亚荣生化仪器厂；Ｓ一１００型旋涡混匀器：　ＴＡＩＹＯ公司；ＢＴ　２２４Ｓ型电子天平：Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司；氮吹　仪：ＳＣＩＮＩＣＳ公司。　１．２主要材料与试剂　市售猪肉（瘦肉部分）；乙腈（分析纯、色谱纯）；三　次蒸馏纯净水；恩诺沙星和环丙沙星标准品：德国Ｄｒ．　Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ　ＧｍｂＨ公司，纯度分别为９２．５％和９４．８％；　草酸溶液：浓度为０．０２　ｍｏｌ／Ｌ；酸化乙腈：乙腈＋（１：１）盐　酸＝９９＋１（体积比）。　１‘３提取方法的选择　农业部第２３６号公告中，以磷酸盐缓冲溶液为提　取剂提取恩诺沙星和环丙沙星　，但磷酸盐缓冲溶液　的提取效果不好，且经过固相萃取后的回收率很低。　本研究采用酸化乙腈进行提取，回收率、重现性均有较　好效果。　１．４试验方法　恩诺沙星和环丙沙星混合标准储备液：精密称取　恩诺沙星和环丙沙星标准品各２０　ｍｇ溶于０．０３　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ，移人１００ｍＬ容量瓶中，加水至刻度，混匀，每毫　升溶液含混合标准品各０．２　ｍｇ。　恩诺沙星和环丙沙星混合标准工作液：吸取１．ＯｍＬ　标准储备液，逐级稀释，加流动相至刻度，混匀，分别配　制０．００２、０．００５、０．０１０、０．０５０、０．１００　ｍｇ／Ｌ标准工作液。　用５０　ｍＬ离心管称取肌肉样品（５＋０．０１）ｇ，加入　１２　ｇ无水硫酸钠，加入２５　ｍＬ酸化乙腈，均质提取　１　ｍｉｎ，５　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，取上清液至５０　ｍＬ分　液漏斗中，再向离心瓶中加入５　ｇ无水硫酸钠、２０　ｍＬ　酸化乙腈，重复以上操作一次。向分液漏斗中加入２５　ｍＬ　正己烷，充分振荡分液漏斗，进行脱脂，静置１　ｍｉｎ后　将下层液收集，将两次回收的溶液合并，６０℃旋转蒸　发至近干，再用氮吹仪吹干，用流动相定容至１　ｍＬ，过　０．４５　ｍ有机滤膜后供高效液相色谱仪分析。　２结果与讨论　２．１色谱条件　１）流动相：第２３６号公告中推荐的流动相中含有　三乙胺，此溶液的添加使机器噪音很大，且对人体的危　害很大，本研究采用草酸溶液（０．０２　ｍｏＵＬ）／乙￣＝８５／１５　作为流动相。　９６　第３１卷第期　４　食品研究与开发　民明ｌＩ，＿　．Ｊ丌蹑　平行，结果如表２。　检测分析　２）流速：在流动相浓度及配比不变的情况下，固　定流动相浓度，在０．６　ｍＬ／ｍｉｎ～１．４　ｍＬ／ｍｉｎ范围内改变　４（０．１０　ｍｇ／ｋｇ）进行标准添加回收率试验，每组做６个　流速。结果表明，随着流速越大，出峰越快，但同时柱　压也越大。综合柱压与分析时间考虑，选取１．０　ｍＬ／ｍｉｎ　表２环丙沙星和恩诺沙星的加标回收试验结果（ｎ　）　Ｔａｂｌｅ２　Ｒｅｃｏｖｅｒｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｕｎｄｅｒｓｔａｎｄａｒｄｍａｔｅｒｉａｌｏｆ　作为分析流速。　３）柱温：３５℃。　ＥＮＲａｎｄＣＩＰ（Ｉ鼻６ｌ　４）荧光检测器激发波长：２８０ｉｌｍ，发射波长：４５０ｎｍ。　环丙沙星和恩诺沙星的混合标准溶液色谱图见图１。　ＦＬＤＩＡ，Ｅｘ＝２８０，Ｅｍ＝４５０（ＥＮＳＸ＼１０２４＼１０２４０００９．Ｄ）　ＬＵ　３８　３７　３６　３５　３４　３３　３２　３１　０　２　４　６　８　ｌ０　ｌ２　ｌ４　ｍｉｎ　图ｌ环丙沙星和恩诺沙星标准的色谱图（Ｏ．２　，Ｌ】　Ｆｉｇ．１　Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ＥＮＲ　ａｎｄ　ＣＩＰ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｆ０．２　）　２．２线性分析试验　分别配制０．００２、０．００５、０．０１０、０．０５０、０．１００　ｍｇ／Ｌ环　丙沙星和恩诺沙星标准混合溶液，依次进样２０　进　行分析，数据如表１所示。　表ｌ环丙沙星和恩诺沙星标准溶液在线形范围内的峰高和相关系数　ＴａＭｅ　１　Ｐｅａｋ　ｈｅｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｆｏ　ＥＮＲ　ａｎｄ　ＣＩＰ　ｕｎｄｅｒ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｒａｎｇｅ　对于环丙沙星：ｒ＝－０．９９９　３；ａ＝３．８１；ｂ＝８　２５７；对于恩　诺沙星：ｒ＝０．９９９　１；ａ一２．３７；ｂ＝８　４４１。　２－３最低定量限试验　当信噪比（ｓ／Ｎ）为１０时，环丙沙星和恩诺沙星的　最低定量限为２　ｇ／Ｉ【ｇ。　２．４回收率试验　对于无公害肉食品，农业部规定的环丙沙星和恩　诺沙星的最大允许残留量为０．１　ｍｇ／ｋｇ，按照ＧＢ／　Ｔ２７４０４—２００８《实验室质量控制规范食品理化检测》的　要求，选取任意一点（０．１２　ｍ　ｇ）和最大允许残留量的　由表２可知，将环丙沙星与恩诺沙星１￣６个峰面　积数值与标准样品峰面积数值进行比较，可知环丙沙　星的回收率为８５％～９０％，恩诺沙星９２％－９９％。经比　较，用此法试验所得的环丙沙星和恩诺沙星的回收率　明显高于农业部第２３６号文件方法。　３结论　本方法建立了高效液相色谱法检测动物组织中恩　诺沙星和环丙沙星药物残留量的高效液相色谱法，该　法具有准确度较高，样品处理简单等优点，可有效监控　畜类食品中危险物质的残留量。本研究确定的最终色　谱条件为：色谱柱：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　１００—５Ｃｌ８（２５０　ｍｍｘ４．６ｍｍ，　５　ｍ）；流动相：草酸溶液／乙￣＝８５／１５；流动相流速：　１．０　ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：３５　ｏＣ；荧光检测器激发波长：２８０ａｍ，　发射波长：４５０　ｎｍ。当信噪比（Ｓ　）为ｌ０时，环丙沙星和　恩诺沙星的最低定量限为２　ｔＬｇ／ｋｇ。恩诺沙星的回收率　为８５％～９０％，环丙沙星的回收率为９２％　９９％。　参考文献：　［１】沈建忠，谢联金．兽医药理学ＩＭ］．北京：中国农业大学出版社，　２００Ｏ：ｌ６２一ｌ６７　【２】Ｒｕｚｉｃｋａ　Ｊ，Ｈａｎｓｅｎ　Ｅ　Ｈ．流动注射分析【Ｍ】．方肇伦，译．北京：北京　大学出版社，ｌ９９１：９１３　［３］ＦＤＡ．ＦＤＡ　Ａｎｎｏｕｎｃｅｓ　Ｆｉｎａｌ　Ｄｅｃｉｓｉｏｎ　Ａｂｏｕｔ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　【ＥＢ／ＯＬ］．ＦＤＡ　Ｎｅｗｓ，（２００５－２８－０７）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｂｂｓ／ｔｏｐｉｃｓ／　ｌｆｅｗｓ￣００５／ｎｅｗＯＩ２ｌ２．ｈｔｍｌ　［４　农业部第２３６号公告．动物源食品中恩诺沙星和环丙沙星残留　４１测定方法［Ｓ】．２００３一Ｏｌ一２２　收稿日期：２００９－０７—２２