《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
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独活寄生汤治疗膝骨关节炎的作用机制 DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1241 ORCID: 0000-0002-2961-8280(吴广文)
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·研究原著·
吴广文1，刘淑如2，陈 俊3，林 洁1，赵忠胜1，叶锦霞1 (1福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350122；2福建中医药大学附属第二人民医院，福建省福州市 350003；3福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建省福州市 350122 )
基于miRNA调控NF-κB/p38 MAPK信号通路探讨独活寄生汤治疗膝骨关节炎作用机制 检测：
(1)miR-146a、miR-155、 NF-κB p65和p38 软骨组织 MAPK基因表达； 独活寄生汤
滑膜组织 (2)NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达； (3)诱导型一氧化氮合酶、 环氧化酶2、基质金属蛋 膝骨关节炎模型
白酶3、13含量 结论： 独活寄生汤可通过调控miR-146a/-155-NF-κB/p38 MAPK信号通路，抑制膝骨关节炎炎症反 应，从而起到治疗膝骨关节炎作用。 文题释义：
MicroRNAs：MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，它的一个重要的生物学功能是广泛参与骨关节炎的炎症反应过程。
NF-κB/p38 MAPK信号通路：NF-κB是一种与炎症因子产生、细胞增殖、细胞外基质交联和细胞凋亡密切相关的转录因子，参与多种炎症的信号转导，在细胞中最常见的作用形式为NF-κB p65及NF-κB p50。p38MAPK信号转导通路参与基质金属蛋白酶的表达。骨关节炎关节滑膜及软骨细胞内的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等均可以激活p38MAPK，后者可通过磷酸化而激活活化剂蛋白1，活化的活化剂蛋白1可以结合到基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13等相应基因启动区，从而启动基质金属蛋白酶过表达。
吴广文，男，1982年生，福建省泉州市人，汉族，2014年福建中医药大学毕业，博士，副研究员，主要从事中西医结合防治骨关节炎研究。
通讯作者：叶锦霞，高级实验师，硕士生导师，福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350122
文献标识码:A
稿件接受：2019-02-28
摘要
背景：前期研究表明独活寄生汤可有效抑制膝骨关节炎炎症反应，但其具体机制尚不明确。
目的：观察独活寄生汤对膝骨关节炎大鼠软骨、滑膜miR-146a/-155-NF-κB/p38 MAPK信号通路相关因子的影响。
方法：SD雄性大鼠36只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验方案经福建中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为[2018]福中医伦理审字第(014)号。大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组(12只)和造模组(24只)。造模组采用改良Hulth法于大鼠右膝关节复制膝骨关节炎模型，造模后1周将造模大鼠随机分为模型组(12只)和实验组(12只)。空白组和模型组给予生理盐水10 mL/(kg•d)灌胃；实验组给予独活寄生汤9.3 g/(kg•d)灌胃。治疗3个月后，麻醉后切取大鼠右膝关节滑膜组织，ELISA法检测诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13含量变化；取大鼠软骨组织，免疫组织化学法检测NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达；Real-time PCR法检测miR-146a、miR-155、NF-κB p65和p38 MAPK基因表达。
结果与结论：①Real-time PCR结果表明独活寄生汤能抑制miR-155、NF-κB p65和p38 MAPK基因表达，促进miR-146a基因表达(P < 0.01)；②免疫组织化学结果与Real-time PCR结果趋势一致，即独活寄生汤能抑制NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达(P < 0.01)；③ELISA结果显示独活寄生汤可有效抑制诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13表达；④结果提示，独活寄生汤可通过调控miR-146a/-155-NF-κB/p38 MAPK信号通路，抑制膝骨关节炎炎症反应，从而起到治疗膝骨关节炎作用。 关键词：
独活寄生汤；膝骨关节炎； NF-κB信号通路；p38 MAPK信号通路；一氧化氮合酶；环氧合酶2；基质金属蛋白酶3；基质金属蛋白酶13 中图分类号：R496；R318 基金资助：
福建省自然科学基金杰青项目(2017J06018)，项目负责人：吴广文；2017年度福建省中医药科技项目(2017FJZYJC204)，项目负责人：吴广文；福建省卫生计生科研人才培养项目资助(2017-ZQN-62)，项目负责人：吴广文；福建省卫生计生中青年骨干人才培养项目资助(2016-ZQN-68)，项目负责人：叶锦霞
Wu Guangwen, MD, Associate researcher, Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Corresponding author: Ye Jinxia, Senior experimentalist, Master’s supervisor, Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
文章编号:2095-4344(2019)19-02965-07 2965
吴广文，刘淑如，陈俊，林洁，赵忠胜，叶锦霞. 独活寄生汤治疗膝骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究，2019，23(19):2965-2971. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1241
Mechanism of Duhuo Jisheng Decoction for treating knee osteoarthritis
Wu Guangwen, Liu Shuru, Chen Jun, Lin Jie, Zhao Zhongsheng, Ye Jinxia (Academy of Integrative Medicine, Fujian University of
2
Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; the Second People’s Hospital of Fujian University of Traditional
3
Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Fujian Provincial Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, Fuzhou 350122, Fujian Province, China)
1
2
3
1
1
11
Abstract
BACKGROUND: Preliminary study has shown that Duhuo Jisheng Decoction can effectively inhibit inflammatory reaction in knee osteoarthritis. But its underling mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of Duhuo Jisheng Decoction on the related regulatory factors in miR-146a/-155-NF-κB/p38 MAPK signaling pathway in cartilage and synovium of rats with knee osteoarthritis.
METHODS: Thirty-six male rats were provided by Shanghai Slack Laboratory Animals Co., Ltd. The study was approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, approval number: [2018] (014). After 1 week of acclimation, the rats were randomly divided into blank group (n=12) and model group (n=24). Osteoarthritis model was induced in rat right knees by modified Hulth method. One week later, the rat models were randomly divided into model control group (n=12) and experiment group (n=12). The blank and model control groups received an equivalent amount of normal saline (10 mL/kg•d) intragastrically. The experiment group received a clinical oral dose of Duhuo Jisheng Decoction (9.3 g/kg•d) intragastrically. After three months of treatment, the animals were sacrificed and synovial tissue and cartilage tissue were obtained. The contents of inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2, matrix
metalloproteinase 3 and matrix metalloproteinase 13 were measured by ELISA. The protein levels of nuclear factor-κB p65 and p38 mitogen-activated protein kinase were detected by immunohistochemistry. The mRNA expression levels of miR-146a, miR-155, nuclear factor-κB p65 and p38 mitogen-activated protein kinase were tested by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Real-time PCR results suggest that Duhuo Jisheng Decoction could inhibit the mRNA expression of miR-155, nuclear factor-κB p65 and p38 mitogen-activated protein kinase, and promote miR-146a mRNA expression (P < 0.01). (2) The results of immunohistochemistry were in agreement with the results of real-time PCR, indicating that Duhuo Jisheng Decoction could inhibit the protein
expression of nuclear factor-κB p65 and p38 mitogen-activated protein kinase (P < 0.01). (3) ELISA results manifest that Duhuo Jisheng Decoction could effectively inhibit the expression of inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2, matrix metalloproteinase 3 and matrix metalloproteinase 13. (4) These results suggest that Duhuo Jisheng Decoction can inhibit the inflammatory reaction in knee osteoarthritis by regulating the miR-146a/-155-NF-κB/p38 MAPK signaling pathway, which may, in part, explain its clinical efficacy in the treatment of knee osteoarthritis. Key words: Duhuo Jisheng Decoction; knee osteoarthritis; nuclear factor-κB signaling pathway; p38 MAPK signaling pathway; nitric oxide synthase; cyclooxygenase 2; matrix metalloproteinase 3; matrix metalloproteinase 13
Funding: the Natural Science Foundation for the Outstanding Youth of Fujian Province, No. 2017J06018 (to WGW); the Chinese Medicine Science and Technology Project of Fujian Province in 2017, No. 2017FJZYJC204 (to WGW); the Talent Training Project of Health and Family Planning Research of Fujian Province, No. 2017-ZQN-62 (to WGW); the Middle-Aged Youth Talent Training Project of Health and Family Planning Research of Fujian Province, No. 2016-ZQN-68 (to YJX)
0 引言 Introduction
膝骨关节炎是一种常见的退行性骨关节疾病，是在力学和生物学等多种因素共同作用下，软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者降解-合成偶联失衡的结果[1]。软骨退变是膝骨关节炎最主要病理变化，是多因素综合作用的结果，其中炎症反应介导的软骨细胞凋亡、软骨基质降解是引起膝骨关节炎软骨退变的关键因素。前期研究表明miR-146a/-155可调控NF-κB和p38 MAPK信号通路[2-4]，而NF-κB和p38 MAPK通路异常激活将引起下游炎症因子过表达，最终导致关节软骨退变，在膝骨关节炎发病中具有重要作用。
独活寄生汤出自《备急千金要方》，长期应用于膝骨关节炎治疗，能有效缓解膝骨关节炎临床症状[5-6]；前期研究表明，独活寄生汤能有效抑制炎性细胞因子、基质金属蛋白酶3、氧自由基的生物效应[7-9]，抑制软骨细胞凋亡[10-11]。但其是否是通过调节miR-146a/-155及其调控的NF-κB和p38 MAPK通路，尚不明确。因此，此次研究以SD大鼠膝骨关节炎动物模型为研究对象，通过观察独活寄生汤对miR-146a/-155及其调控的NF-κB和p38 MAPK通路的影响，阐明独活寄生汤治疗膝骨关节炎的作用机制，为独活寄生汤的临床应用提供实验依据。
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1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 2017年10月至2018年9月在福建中医药大学中西医结合研究院和福建中医药大学实验动物中心完成。 1.3 材料
1.3.1 实验动物 2月龄SPF级雄性SD大鼠36只，体质量：250-280 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK(沪)2017-0005。实验方案经福建中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为[2018]福中医伦理审字第(014)号。
1.3.2 药物 独活寄生汤组成药物购于福建中医药大学附属第二人民医院。独活寄生汤由独活9 g、桑寄生6 g、牛膝6 g、杜仲6 g、秦艽6 g、防风6 g、肉桂6 g、细辛6 g、川芎6 g、当归6 g、芍药6 g、干地黄6 g、人参6 g、茯苓6 g、甘草6 g组成；生药浓度为2.269 g/mL。
1.3.3 实验用主要试剂 木瓜蛋白酶(美国Genview 公司)；mirVana™ miRNA Isolation Kit(美国Life Technologies公司)；NF-κB p65和p38 MAPK抗体(美国cell signaling公司)；VECTASTAIN® Elite ABC试剂盒和DAB显示试剂盒(美国Vector Laboratories公司)；诱导型一氧化氮
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
Wu GW, Liu SR, Chen J, Lin J, Zhao ZS, Ye JX. Mechanism of Duhuo Jisheng Decoction for treating knee osteoarthritis.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(19):2965-2971. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1241
合酶(iNOS)检测试剂盒、细胞色素C氧化酶亚型Ⅱ(COX2)检测试剂盒、基质金属蛋白酶3(MMP3)检测试剂盒、基质金属蛋白酶13(MMP13)检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)；miR-146a、miR-155引物[通用生物系统(安徽)有限公司]；NF-κB p65和p38 MAPK引物(福州尚亚生物技术有限公司)。
1.3.4 实验用主要仪器 生物组织自动脱水机(亚光医用电子技术有限公司)；生物组织石蜡包埋机(湖北孝感亚光医用电子技术有限公司)；全自动石蜡切片机(徕卡仪器有限公司)；多功能图象分析系统(美国Media Cybernetics公司)；蛋白核酸分析仪(美国Beckman Coulter公司)；ABI 7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)。 1.4 实验方法
1.4.1 动物分组与模型制备 健康2月龄SPF级雄性SD大鼠36只，适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组(12只)和造模组(24只)。空白组不做任何处理，造模组采用改良Hulth法于大鼠右侧膝关节复制膝骨关节炎模型[11]。造模后连续3 d青霉素20×104 U肌注，2次/d。
造模后1周，随机数字表法分为：模型组(12只)和独活寄生汤临床等效剂量组(实验组，12只)；空白组和模型组给予生理盐水，按照10 mL/(kg•d)的量进行灌胃，实验组根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算[12]，按照9.3 g/(kg•d)的药量进行灌胃，连续治疗3个月。
实验动物造模过程的相关问题： 造模目的：
观察独活寄生汤对miR-146a/-155及其调控的NF-κB
和p38 MAPK通路的影响
借鉴已有标准实施动
参考文献[11]采用改良Hulth法复制大鼠膝骨关节炎模物造模：
型
选择动物的条件： ①SD大鼠；②雄性；③2月龄；④体质量250-280 g； ⑤SPF级
动物来源及品系：
SD大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司 模型与所研究疾病的 以SD大鼠膝骨关节炎动物模型为研究对象，揭示独活关系：
寄生汤治疗膝骨关节炎抗炎机制
造模技术描述：
麻醉后，取膝关节内侧入路，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前交叉韧带[11]，缝合
动物数量及分组方法： SD大鼠36只，采用随机数字表法分为空白组n=12和
造模组n=24
造模后实验观察指标： ①大鼠关节软骨组织miR-146a、miR-155的表达；②大
鼠关节软骨组织NF-κB p65和p38 MAPK mRNA和蛋白 的表达；③对大鼠滑膜组织中诱导型一氧化氮合酶、环氧 合酶2、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平 造模过程中动物死亡
模型组麻醉意外致死1只，实验组在灌胃过程中出现腹原因及补充： 泻致死1只，均给予补全
造模后动物处理：
末次灌胃结束后，腹腔注射麻醉大鼠，收集大鼠右侧膝
关节滑膜组织和软骨组织
伦理委员会批准； 实验方案经福建中医药大学动物实验伦理委员会批准 (批准号为[2018]福中医伦理审字第(014)号)
P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org
1.4.2 组织取材与处理 末次灌胃结束后，体积分数10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉，打开关节腔，收集大鼠关节滑膜组织，置于液氮中，储存备用。切取右侧胫骨平台内侧软骨组织，40 g/L多聚甲醛固定24 h，10% EDTA-2Na脱钙8周后，常规石蜡包埋，免疫组织化学染色检测NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达；其余软骨组织迅速置入液氮中储存，Real-time PCR法检测miR-146a、miR-155、NF-κB p65和p38 MAPK表达。
1.4.3 Real-time PCR法检测各组软骨组织中miR-146a、miR-155表达 用液氮将各组软骨组织研磨匀浆后，参照mirVana™ miRNA Isolation Kit提取试剂盒说明书提取miRNA，核酸分析仪检测各样本RNA浓度(g/L)和A260/280值。取1 μg miRNA反转录成cDNA，反转录条件：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min，4 ℃。以此为模板扩增miRNA 146a、miRNA155和U6。扩增反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30-34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以U6为内参照基因，检测目的基因表达，用2-
∆∆Ct相对定量法计算miRNA 146a、miRNA155
表达水平。
1.4.4 Real-time PCR法检测各组软骨组织中NF-κB p65和p38 MAPK mRNA表达 用液氮将各组软骨组织研磨匀浆后，根据Trizol试剂盒说明书提取总RNA；核酸分析仪检测各样本RNA浓度(g/L)和A260/280值。根据反转录试剂盒说明书，取1 μg mRNA反转录成cDNA，反转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。以1 μL cDNA为模板扩增NF-κB p65、p38 MAPK和GAPDH。扩增反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。以GAPDH为内参照基因，计算各目的基因2-
∆∆Ct，比较分析各目的基因
mRNA的相对表达水平。
1.4.5 免疫组织化学染色检测各组软骨组织中NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达 将上述关节软骨石蜡包埋块，切片，二甲苯脱蜡；梯度乙醇脱水；10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液中，微波修复20 min；含0.3% Triton X-100的3%H2O2室温孵育10 min；体积分数5%正常山羊血清封闭30 min；含1% BSA抗体稀释液稀释的一抗NF-κB p65(1∶800)、p38 MAPK(1∶400)工作液4 ℃孵育过夜；二抗工作液 37 ℃孵育 60 min；滴加ABC工作液37 ℃孵育60 min；DAB显色；苏木精复染；二甲苯透明，封固。在200倍镜下每份样本随机选取5个视野，获取图像。免疫组织化学评分标准参照文献[13]进行。
1.4.6 ELISA检测滑膜组织中诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平 取出液氮中保存备用的滑膜组织，秤取20 mg，按1 g∶10 mL
比例加入无菌PBS，冰上超声粉碎，充分震荡后4℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清液。按照梯度稀释法配置标准品，设计好上样孔坐标后，分别加入标准品、质控和
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吴广文，刘淑如，陈俊，林洁，赵忠胜，叶锦霞. 独活寄生汤治疗膝骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究，2019，23(19):2965-2971. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1241
样品，震荡均匀，37 ℃烘箱孵育2 h，自动洗板仪洗板3次，加入抗体，37 ℃烘箱孵育。自动洗板仪洗板后加入酶结合物孵育，加入显色剂，最后加入终止液终止反应，酶标仪450 nm波长测A值。绘制标准曲线并计算各样品诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13浓度。
1.5 主要观察指标 ①大鼠关节软骨组织miR-146a、miR-155的表达；②大鼠关节软骨组织NF-κB p65和p38 MAPK mRNA和蛋白的表达；③对大鼠滑膜组织中诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平。
1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析。计量资料数据符合正态分布，用x±s表示，采用单因素方差分析，方差齐用LSD检验，方差不齐用Tamhane’s T2检验；数据不符合正态分布，以中位数(四分间距位)表示，采用非参数检验。P < 0.05为差异有显著性意义。
_
1.468 8±0.062 8，差异均有非常显著性意义(P < 0.01)。与模型组相比，实验组miR-146a表达显著上升，miR-155表达显著下降均P < 0.01)。见图1。
2.3 大鼠关节软骨组织NF-κB p65和p38 MAPK mRNA的表达 与空白组相比，模型组NF-κB p65表达升高到 1.515 2±0.068，p38 MAPK表达升高到1.854 3±0.068 9，差异均有显著性意义(P < 0.01)；实验组NF-κB p65表达升高到1.147 2±0.053 3，p38 MAPK表达升高到1.311 8± 0.034 8，差异均有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)。与模型组相比，实验组NF-κB p65、p38 MAPK表达均显著下降(P < 0.01)。见图2。
2.4 大鼠关节软骨组织NF-κB p65和p38 MAPK蛋白的表达 NF-κB p65、p38 MAPK阳性染色呈棕黄色或棕褐色，见图3，4。
比较各组阳性率，可见各组对NF-κB p65、p38 MAPK蛋白表达的影响与其对NF-κB p65、p38 MAPK mRNA的影响具有相同的趋势，与空白组相比，模型组NF-κB p65、p38 MAPK阳性率显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，实验组NF-κB p65、p38 MAPK阳性率均显著降低(P < 0.01)。见图3D，图4D。
2.5 大鼠滑膜组织诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平 与空白组相比，模型组和实验组诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平均显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，实验组上述4项指标检测值均显著
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠36只，分为3组，实验过程中，模型组麻醉意外致死1只，实验组在灌胃过程中出现腹泻致死1只，均给予补全后，36只大鼠进入结果分析。
2.2 大鼠关节软骨组织miR-146a、miR-155的表达 与空白组相比，模型组miR-146a表达下降到0.092 8±0.012 1，miR-155表达升高到1.950 7±0.052 7；实验组miR-146a表
达下降到0.763 0±0.032 7，miR-155表达升高到 降低 (P < 0.01)。见图5。
A miRNA 146a表达
1.2
B miRNA 155表达
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
图注：图A为 miR-146a表达；B为miR-155表达。与空白组比较，P < 0.01；与模型组比较，P < 0.01。
图1 干预后各组大鼠关节软骨组织miR-146a和miR-155表达
Figure 1 Expression of miR-146a and miR-155 in rat articular cartilage tissue of each group after treatment
b
a
1.0 0.8 0.6 0.4
0.2
0
A
2.0
B
2.5 p38 MAPK表达 2.0 1.5 1.0 0.5 0
图注：图A为NF-κB p65 mRNA表达；B为p38 MAPK mRNA表达。与空白组比较，P < 0.01，P < 0.05；与模型组比较，P < 0.01。 图2 干预后各组大鼠关节软骨组织NF-κB p65和p38 MAPK mRNA表达 Figure 2 mRNA expression of nuclear factor-κB p65 and p38 mitogen-activated protein kinase in rat articular cartilage tissue of each group after treatment
b
c
a
1.5
NF-κB表达
1.0
0.5
0
2968
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Wu GW, Liu SR, Chen J, Lin J, Zhao ZS, Ye JX. Mechanism of Duhuo Jisheng Decoction for treating knee osteoarthritis.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(19):2965-2971. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1241
a
D NF-κB阳性率(%) 50 40 30 20 10 0
b
图注：图A为空白组；B为模型组；C为实验组，D为各组阳性率比较。与空白组比较，P < 0.01；与模型组比较，P < 0.01。
干预后各组大鼠关节软骨组织NF-κB p65蛋白表达(×200) 图3
Figure 3 Protein expression of nuclear factor-κB p65 in rat articular cartilage tissue of each group after treatment (×200)
D P38MAPK阳性率(%) a
35 30 25 20 15 10 5 0
b
图注：图A为空白组；B为模型组；C为实验组；D为各组阳性率比较。与空白组比较，P < 0.01；与模型组比较，P < 0.01。 图4 干预后各组大鼠关节软骨组织p38 MAPK蛋白表达(×200)
Protein expression of p38 mitogen-activated protein kinase in rat articular cartilage tissue of each group after treatment (×200) Figure 4
诱导型一氧化氮合酶(μg/L) A
1.2 1.0 0.8
B C 基质金属蛋白酶3(μg/L)
0.6 0.4 0.2 0
D 基质金属蛋白酶13(μg/L) 环氧合酶2(μg/L)
图注：图A为诱导型一氧化氮合酶结果比较；B为环氧合酶2结果比较；C为基质金属蛋白酶3结果比较；D为基质金属蛋白酶13结果比较。与空白组比较，P < 0.01；与模型组比较，P < 0.01。
图5 干预后各组大鼠滑膜组织诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平
Figure 5 Contents of inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2, matrix metalloproteinase 3 and matrix metalloproteinase 13 in rat synovial tissue of each group
after treatment
b
a
3 讨论 Discussion
关节软骨包括软骨细胞和细胞外基质两部分，软骨细胞是一种代谢活跃的细胞，在维持关节软骨结构和功能中具有重要作用[14]。在膝骨关节炎发病过程中，炎症因子通过介导软骨细胞分化，诱导软骨细胞表型变为成纤维细胞表型，促进软骨细胞凋亡，周围组织纤维化。而这些途径主要包括细胞核因子κB(NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等[15]。NF-κB存在于各种类型的细胞中，控制着各种基因转录，影响着细胞的生长、分化、凋亡等[16-18]。NF-κB在许多免疫、炎症反
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应中起着重要的调节作用，特别是参与大量细胞因子及其受体、Toll受体等的表达调控[19-22]，在细胞中最常见的作用形式为NF-κB p65及NF-κB p50。未受刺激时以非活化形式存在，并结合在一个或几个抑制性的κB蛋白(inhibitory, κB，IκB)上，形成NF-κB/IκB复合物。IκB不仅阻止NF-κB的核内转录，也阻止其在胞质与核内的穿梭。IκB的活性又被IκB激酶(IκB kinases，IKK)控制。当细胞受到促炎因子等刺激，会激活IKK使IκB磷酸化，IκB磷酸化后发生泛素化，引起IκB水解，释放NF-κB，使之恢复活性并从细胞质转移到细胞核，调节NF-κB依赖的基因表
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吴广文，刘淑如，陈俊，林洁，赵忠胜，叶锦霞. 独活寄生汤治疗膝骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究，2019，23(19):2965-2971. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1241
达[23]，如诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、白细胞介素6和白细胞介素8等，进而对细胞损伤、炎症等起到一定的促进作用。此次研究采用Real-time PCR和免疫组织化学染色方法，从基因和蛋白2个方面检测NF-κB p65表达，结果发现与空白组相比，NF-κB p65表达明显增多，而经过独活寄生汤治疗后NF-κB p65表达量明显下降。ELISA检测结果也发现模型组滑膜组织中诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2含量明显高于空白组，经过独活寄生汤治疗后，诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2含量明显下降。基于以上研究结果，考虑独活寄生汤可能是通过调节NF-κB信号通路，进而调节诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2表达。
软骨细胞外基质主要由Ⅱ型胶原和蛋白聚糖组成，Ⅱ型胶原主要为组织提供拉伸支持作用，蛋白聚糖为负载软骨提供抗压耐冲击吸收能力。在骨关节炎中，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖含量下降。基质金属蛋白酶是一系列破坏细胞外基质的蛋白酶，可导致软骨基质破坏进而导致关节结构功能紊乱。p38MAPK信号转导通路参与基质金属蛋白酶的表达。骨关节炎关节滑膜及软骨细胞内的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等均可以激活p38MAPK，后者可通过磷酸化而激活活化剂蛋白1，活化的活化剂蛋白1可以结合到基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13等相应基因启动区，从而启动基质金属蛋白酶过表达[24]。其中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶3可以在胶原纤维的三维螺旋区裂解胶原纤维，且对Ⅱ型胶原的活性最强。此次研究采用Real-time PCR和免疫组织化学染色方法，从基因和蛋白2个方面检测p38MAPK表达，结果发现与空白组相比，p38MAPK表达明显增多，而经过独活寄生汤治疗后p38MAPK表达量下降。ELISA检测结果发现模型组滑膜组织中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13含量明显升高，经过独活寄生汤治疗后，基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13含量明显下降。基于以上研究结果，考虑独活寄生汤可能是通过调节p38MAPK信号通路，进而调节基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13表达。
MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，它的一个重要的生物学功能是广泛参与骨关节炎的炎症反应过程，尤其是炎症因子介导的软骨细胞凋亡[25]。如miR-146是对炎症反应及免疫系统具有调节作用的一种小分子RNA，包括miR-146a和miR-146b，当机体受到Toll-like受体配基、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β刺激时，巨噬细胞中miR-146的表达就会上调，进而负反馈调节炎症细胞因子的产生和表达[26]。Taganov等[4]用TLR4配体刺激单核细胞系的过程中发现miR-146a的表达升高。脂多糖首先与血清中脂多糖结合蛋白结合，然后再结合于细胞表面的CDI4分子，脂多糖、LBP及CDI4三体复合物形式活化
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TLR4信号传导，进而激活TRAF6和IRAK1，诱导NF-κB信号通路激活，从而启动炎症因子瀑布反应。另有研究显示，将miR-146a注射入类风湿关节炎小鼠模型中，结果类风湿关节炎小鼠的病情明显减轻[27-28]，这些研究说明炎症反应可以引起miR-146a反馈性增高，而miR-146a增高的目的可能在于抑制炎症反应的发生发展，改善炎症损伤。故miR-146a的检测可以作为炎症反应病情活动的判断指标[29]。此次研究Real-time PCR结果发现，与空白组相比，模型组中miR-146a含量降低，但经过独活寄生汤治疗后，miR-146a含量明显增加。miR-155是新近发现的另外一个与炎症反应相关的小分子RNA，可参与炎症、免疫等多种生物学过程，其表达异常与炎症、自身免疫病等疾病的发生密切相关。miR-155在关节炎中起促炎作用；同时，miR-155还可以通过促进炎性T细胞的活化，引起自身免疫性炎症反应的发生[30-31]。此次研究Real-time PCR结果发现，与空白组相比，模型组中miR-155含量增加，经过独活寄生汤治疗后，miR-155含量明显降低。研究结果与前期Ceppi等[2]学者的研究结果相一致，p38MAPK与NF-κB炎症通路受到miRNA的广泛调控，例如miR-155能够抑制p38MAPK和NF-κB信号，从而负向调节TLR/白细胞介素1介导的炎症通路[2]；miR-146a则通过激活白细胞介素1受体相关蛋白激酶1和肿瘤坏死因素受体相关因子6，减少基质金属蛋白酶13、聚蛋白多糖酶5对Ⅱ型胶原和蛋白多糖的降解，抑制上述炎症通路的激活[3]。
综上考虑，独活寄生汤可能是通过调控miR-146 a/-155，进而调节NF-κB/p38 MAPK信号通路，起到抑制膝骨关节炎炎症反应作用，最终达到治疗膝骨关节炎目的。
作者贡献：吴广文进行实验设计，实验实施为刘淑如、林洁、赵
忠胜，实验评估为叶锦霞，资料收集为陈俊，吴广文成文并审校。
经费支持：该文章接受了“福建省自然科学基金杰青项目
(2017J06018)”“2017
年度福建省中医药科技项目
(2017FJZYJC204)”“福建省卫生计生科研人才培养项目资助(2017-ZQN-62)”和“福建省卫生计生中青年骨干人才培养项目资助(2016-ZQN-68)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中
不存在利益冲突。
机构伦理问题：实验方案经福建中医药大学动物实验伦理委员会
批准，批准号为[2018]福中医伦理审字第(014)号。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次
查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章
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ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
Wu GW, Liu SR, Chen J, Lin J, Zhao ZS, Ye JX. Mechanism of Duhuo Jisheng Decoction for treating knee osteoarthritis.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(19):2965-2971. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1241
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