一、酶工程基础 酶：生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 酶工程：是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学。从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质 。 酶学理论的各种学说：锁钥学说、中间产物学说、米氏学说、诱导契合学说、操纵子学说。
酶的转换数：以一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数来表示酶的催化效率。每个活性中心/每个分子酶所能转化的底物分子数。 酶活力：(酶活性)指酶催化一定化学反应的能力。
酶活性中心：酶分子与底物结合并将底物转化为产物的空间结构区域。特点：1.只有几个氨基酸组成，多为极性氨基酸；2.是一个三维实体结构，活性中心的几个氨基酸残基在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同肽链上；3.通过次级键与底物的结合；4.具有柔性，可与底物诱导契合发生相互作用；5.位于酶分子表面的“空穴”中，为极性环境。必须基团：酶分子中与酶活性相关的基团（羟基、巯基、咪唑基和羧基）。活性中心内必需基团——结合和催化；活性中心结合和催化活性中心外必需基团—— 维持酶构象。
酶催化的特点：1.极高的催化效率；2.高度的专一性：结构和立体异构及绝对专一性；3.活性的可调节性；4活性的不稳定性，易失活。
影响酶催化作用的因素：底物、产物、酶的浓度和温度、PH、抑制剂、激活剂对酶反应速度的影响
酶抑制剂的作用原理：有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的结构和性质发生改变使酶的活性中心的结构和性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为酶的抑制作用。不可逆抑制作用：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤
或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活。可逆抑制作用。
动力参数改变情况：竞争性抑制：值增大，值不变；非竞争性抑制：值不变，值变小；反竞争性抑制：值变小，值变小，但/值不变。 酶的比活力又称比活性：指在特定条件下，单位质量蛋白质或指在特定条件下，单位质量蛋白质或RNA 所拥有的酶活力单位数 。 米氏方程：v=Vmax×[S]/（Km+[S])其中 Km 值称为米氏常数，Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。意义：①米氏方程中提到了几个重要的酶反应动力学常数，即Km、k1,、k2、k-1、k-2。通过它们可以反映出性质、反应条件、反应速率之间的关系。②v=Vmax×[S]/（Km+[S])反映了速度与底物之间的关系③另外米氏方程还反映了酶反应速度与酶浓度的关系，v=[E0]k2×[S]/（Km+[S])。 米氏常数的意义： ⒈它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕 它可以表示酶和底物之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。2. 它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。3.它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。4. Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。
二、酶的发酵工程
操纵子： 由调节基因、启动子、操纵基因和结构基因所构成的一个完整的基因表达单位。
启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。 操纵基因：位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生
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的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。
结构基因：决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。
调节基因：可产生一种组成型调节蛋白（一种变构蛋白 ），通过与效应物（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 诱导酶：在正常细胞中没有或只有很少量存在，但在酶诱导的过程中，由于诱导物的作用而被大量合成的酶。
组成酶：在细胞中的含量比较稳定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大，这类酶称之为~
原核生物调节方式：主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式。
酶生物合成的模式：①同步合成型：酶的合成与细胞的生长同步。特点：合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反馈阻遏。酶对应的mRNA很不稳定。②延续合成型：酶的合成伴随着细胞的生长而开始，细胞生长进入稳定期后，酶还可以延续合成一段时间。特点：合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反馈阻遏。酶对应的mRNA相当稳定。③中期合成型：
酶的合成在细胞的生长一段时间以后才开始，细胞进入稳定期后，酶的合成也随之停止。特点：合成受到反馈阻遏。酶对应的mRNA 不稳定。④滞后合成型：当细胞生长进入稳定期以后，酶才开始合成并大量积累。特点：受分解代谢物阻遏，酶对应的mRNA稳定性高。
最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中无生长期和产酶期的明显区别，细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。
提高产酶措施：1.添加诱导物2.降低阻遏物浓度3.表面活性剂4.添加产酶促进剂。 酶分离流程：预处理【发酵液的预处理，细胞的破碎】—酶的提取—酶的分离纯化—酶的浓缩干燥结晶。
四、固定化酶与固定化细胞 固定化酶：是指在一定空间内呈闭锁状态存
在的酶，连续的进行反应，反应后的酶可以
回收重复使用 。 固定化原理：通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。方法：吸附法：操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可以反复使用。但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶和载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定限制。包埋法：又分为凝胶包埋法，半透膜包埋法。1.天然凝胶在包埋时条件温和，操作简便，对酶活性影响甚少，但强度较差。而合成凝胶的强度较高，对温度，PH值变化的耐受性强，但需要在一定的条件下进行聚合反应，才能把酶包埋起来。2.半透膜的孔径为几埃至几十埃，比一般酶分子的直径小些，固定化的酶不会从小球中漏出来。 结合法：又分为离子键结合法和共价键结合法。1.离子键结合法是通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。用离子键结合法制备的固定化酶，活力损失少。但由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在PH值和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。2.通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间，但载体活化的操作复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。交联法：交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。 热处理法：热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
固定化酶的优点：①极易将固定化酶与底物、产物分开；②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；④酶反应过程
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能够加以严格控制；⑤产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；⑥较游离酶更适合于多酶反应；
⑦可以增加产物的收率，提高产物的质量；⑧酶的使用效率提高，成本降低。固定化酶的缺点：①固定化时酶活力有损失；②增加了生产的成本，工厂初始投资大；③只能用于可溶性底物，而且存在扩散限制，较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；④与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；⑤胞内酶必须经过酶的分离手续。
固定化酶的性质和影响因素：有以下效应：1、构象效应：酶在固定化的过程中，出于 酶与载体相互作用使酶的活性中心或变构中心的酶在固定化的过程中构象发生变化从而导致了酶与底物结合能力或酶催化底物转化的能力降低，导致酶活性下降。2、屏蔽效应：由于载体对酶的活性中心或变构中心造成空间障碍，因而底物或效应物与酶无法接触，从而影酶的活性。若在酶和载体间加入连接臂，可以得到改善；3、微扰效应：微环境是紧邻固定化酶的环境区域。微环境的影响是由于载体的亲水与疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化效率，或者是酶对效应物作出反应的能力的一种效应，通常可以通过改变载体和介质的性质作出判断和调节。4、分配效应：由于载体的亲水或疏水性质以及带电特性使酶的底物、产物或其他效应物在固定化酶所处微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响了反应速度。5、扩散限制效应：底物或其他效应物在酶的微环境区与宏观体系之间微环境区与宏观体系之间的迁移和运转速度受到限制的一种效应。
变化：1、固定化后酶活力的变化（酶的活力变小）2、固定化对酶温度的影响（稳定性增加）；3、固定化酶的最适温度提高；4、固定化酶最适PH值发生偏移；5、固定化酶底物特异性的变化：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。6、固定化酶
动力学参数的变化：固定化可以使酶分子的空间构象发生一定程度的改变，可以影响到酶分子与底物的亲和力，造成酶分子Km值的变化。
五、酶分子的修饰：通过各种方法可以使酶分子结构发生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。 酶分子的化学修饰：表面和内部修饰。定义：通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性，这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术，称为酶分子的化学修饰。
酶的化学修饰原因：1.稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2.作用的最适条件不符。3.酶的主要动力学性质的不适应。4. 临床应用的特殊要求。目的：1. 改变活性部位的构象，研究酶的结构与功能的关系。2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。①提高酶的生物活性（酶活力）。②增强酶在不良环境( 非生理条件)中的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。③消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。④改变酶学性质，产生新的催化能力。
酶化学修饰的原理：大量的实验研究表明，酶分子表面外形的不规则、各原子间极性和电荷的不同、各氨基酸残基间相互作用等使酶分子空间结构的局部形成了一个包含了活性部位的微环境，不论这个微环境是极性的还是非极性的，都直接影响到酶活性部位氨基酸残基的解离状态，并为活性部位发挥催化作用提供合适的条件。天然酶分子中的这种微环境可以通过 人为的方法进行适当的改造，对酶分子的侧链基团、酶分子的功能基团进行化学修饰或改造 ，就可以获得结构更合理、功能更完善的修饰酶。
酶分子的修饰方法：表面：1、化学固定化；2、酶分子侧基团的化学修饰；3、酶的大分子修饰。内部：1、酶蛋白主链修饰；2、氨基酸置换修饰；3、肽链伸展后的修饰；4、酶的金属离子置换修饰。 模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子，这些物质可以模拟酶对其作用底物作用
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底物结合和催化过程，所以叫模拟酶。 六、酶的定点突变：通过取代、插入或删除己知 DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中某个或某些特定的氨基酸，以此来提高酶对底物的亲和力，增强酶的专一性等。方法：易错PCR、DNA重组、外显子改组、随机引物重组法、交错延伸法。 定向进化：人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。优点：⑴提高酶分子的催化活力⑵改善酶蛋白的稳定性⑶改善酶蛋白的底物专一性；⑷通过酶蛋白分子对应用环境的适应能力。 七、核酶
剪接型核酶：既剪又接的方式除去间隔序列。首先切除自身RNA内一个核苷酸片段，再将剪切后剩下的两个片段连接起来，实现mRNA 前体的自我拼接反应。分为I型IVS:通过转磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA及G- IVS，G- IVS 经两次环化生成L - 19IVS 。 催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。II型IVS：通过转磷酸酯反应，生成成熟的 RNA及套环状的IVS。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg2+
)。
剪切型核酶：催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶(只切不接)，主要包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及有蛋白质参与协助完成催化的蛋白质——RNA复合酶。
八、有机介质中的酶催化：是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用 。
有机介质中酶促反应的影响因素：1、水对有机介质中酶催化反应的影响（①水对酶分子空间构象的影响②水对有机介质酶催化反应速度③水对酶催化反应平衡及立体选
择性的影响④有机介质反应体系中水含量的调控）；2、有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响（①有机溶剂对酶活性的影响②有机溶剂对底物和产物分配的影响③有机溶剂的结构对酶促反应的影响④有机溶剂的选择）；3、PH值对有机介质酶催化反应的影响；4、酶的形态对有机介质中酶催化的影响；5、温度对有机介质酶催化反应的影响；6、添加物对有机介质酶催化反应的影响。
有机介质中酶酶活性下降的原因：1、传质的障碍；2、有机溶剂增加酶促反应活化能；3、有机介质中酶分子活性中心刚性增加。 酶稳定性的变化：1热稳定、酶的储存稳定性、酶对变性剂的稳定性都增加。
最适含水量：在特定的有机介质中，催化速度达到最大时的含水量。 分子印迹：是把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程,以供进一步从中分离纯化出来所需要的酶。
pH记忆：将酶分子从水溶液转移到有机溶剂中，酶能保持原有的离子化状态，此时的环境因素也不能改变酶分子的这种状态，或者说酶在缓冲液中所处的pH状态仍被保持在有机溶剂中的这种现象。
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