基因重组酵母发酵木糖产酒精的研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 第２７卷第３期　２００７年６月　林　产　化　学　与　工　业　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｖｏ１．２７　Ｎｏ．３　Ｊｕｎｅ　２００７　基因重组酵母发酵木糖产酒精的研究　王周芳，陈明，王冰冰，夏黎明　（浙江大学化学工程与生物工程系，浙江杭州３１００２７）　摘要：　以一株基因重组酵母为研究对象，探讨了厌氧条件下ｐＨ值、底物浓度、接种量、乙酸质　量分数和葡萄糖添加量等关键因子对木糖发酵的影响。结果表明，重组酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ　中图分类号：ＴＱ９２；Ｑ９３２　文献标识码：Ａ　文章编号：０２５３—２４１７（２００７）０３—００３３—０４　Ｅｔｈａｎｏｌ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｘｙｌｏｓｅ　ｂｙ　ａ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｙｅａｓｔ　ＷＡＮＧ　Ｚｈｏｕ－ｆａｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｍｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｂｉｎｇ—ｂｉｎｇ，ＸＩＡ　Ｌｉ—ｍｉｎｇ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２７，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｋｅｙ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｅｎｔｈａｎｏｌ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｘｙｌｏｓｅ　ｂｙ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｙｅａｓｔ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｗｉｔｈ　８０　ｇ／Ｌ　ｘｙｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｏｆ　１，２　ｇ／Ｌ（ｃｅｌｌ　ｄｒｙ　ｗｅｉｇｈｔ）ａｔ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　５．５，３０℃ｕｎｄｅｒ　ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ａｎｄ　２８．９　ｇ／Ｌ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈｉｎ　７２　ｈ．Ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｆ　ｍａｓｓ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　０．０５％ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃａｕｓｅｄ　ｍｉｎｏｒ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆａｖｏｒｅｄ　ｆｅｒｍｅｎ－　ｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｘｙｌｏｓｅ，ａｎｄ　８５．７％ｘｙｌｏｓｅ　ｗａｓ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｗｉｔｈｉｎ　３６　ｈ　ａｔ　４０　Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　３０　ｇ／Ｌ　ｘｙｌｏｓｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｘｙｌｏｓｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｙｅａｓｔ　当前石油能源危机１３益严重…，中国是石油消费大国，但石油资源却相对贫乏，为减少对石油进口　的依赖，原国家计委于２００１年宣布将全面推广使用乙醇汽油　ｊ。乙醇是可再生的最有发展前景的液态　燃料　，目前国内主要以玉米、小麦等粮食淀粉经微生物发酵生产。我国拥有丰富且廉价的植物纤维　资源，尤其是农林废弃物，生物转化植物纤维原料生产乙醇，对中国经济和社会的可持续发展具有重大　意义。木糖是植物中含量仅次于葡萄糖的一种水解单糖，占水解糖的３５％，因此将木糖转化成乙醇是　植物纤维生产乙醇的关键　。自然界中发酵木糖的酵母菌有Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｈｅｈａｔａｅ和Ｐａｃｈｙｓｏ．　１ｅｎ　ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ，但它们对酒精的耐受能力较差，发酵液中乙醇浓度低，且要求“半好氧”的发酵条件，不　适合乙醇的工业化生产　。传统的乙醇工业生产菌酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）具有易培养、耐　高糖、厌氧发酵、乙醇得率高、乙醇耐受性高和发酵能力强等优点，但由于缺乏木糖代谢途径的关键酶，　因而不能利用木糖，但它可以发酵木酮糖生成乙醇　Ｊ。作者以一株基因重组酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０为　研究对象，对厌氧条件下发酵木糖产乙醇的关键因子进行了研究。　１材料和方法　１．１试剂与仪器　木糖，浙江华康药业有限公司；木糖和木糖醇标准样，Ｓｉｇｍａ公司；乙醇标准样，分析纯；Ｓｙｈｅｃｈ　收稿日期：２００６—０５—２２　基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０４７６０９１）；浙江大学学科交叉预研基金资助项目（无编号）　作者简介：王周芳（１９８２一），女，浙江绍兴人，硕士生，主要从事生物化工方面的研究　通讯作者：夏黎明，博士生导师，主要从事可再生资源利用方面的研究。　维普资讯 http://www.cqvip.com 林产化学与工业　第２７卷　ｍｏｄｅｌ　５００高效液相色谱仪；Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ　ＩＣ　Ｓｅｐ　ＩＣＥ—Ｃｏｒｅｇｅｌ　８７Ｈ３（３００　ｍｍ×７．８　ｍｍ）有机酸柱；　Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ　６０４０　ＸＲ示差折光监测器。　１．２菌种　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ－１０，为本实验室构建的基因重组酵母，带有来自Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ的木糖还原酶、木糖醇　脱氢酶以及木酮糖激酶基因，可在厌氧条件下发酵木糖产乙醇。该菌种保存在以木糖为单一碳源的斜　面培养基上。　１．３培养基　斜面培养基（ｇ／Ｌ）：木糖２０，蛋白胨１０，酵母膏５，琼脂２０，自然ｐＨ值。种子培养基（ｇ／Ｌ）：木糖１０，　葡萄糖ｌＯ，蛋白胨ｌＯ，酵母膏５，自然ｐＨ值。发酵培养基（ｓ／Ｌ）：木糖８Ｏ，蛋白胨３，酵母膏２，ＣａＣ１　０．２５，ＭｇＣ１２　０．２５，ＫＨ２ＰＯ４　２．５，ｐＨ值５．５。　１．４种子液的制备　斜面接种后于３０　ｃｃ培养４８　ｈ。将斜面菌种接入装有５０　ｍＬ种子培养基的２５０　ｍＬ的三角瓶中，于　３０　ｏＣ，１８０　ｒ／ｍｉｎ下培养３６　ｈ。种子液于４０００　ｒ／ｍｉｎ下离心５　ｍｉｎ，收集到的细胞沉淀用于接种发酵培　养基。　１．５乙醇发酵　所有乙醇发酵试验均在装有５０　ｍＬ发酵培养基的１００　ｍＬ三角瓶中进行，瓶口塞上橡皮塞（插有针　头）以控制厌氧条件，置３０　ｏＣ，１２０　ｒ／ｍｉｎ的恒温振荡器内振荡发酵。除特别指明，发酵液接种后初始细　胞质量浓度均为１．２　ｇ／Ｌ（以干质量计，下同），发酵时间为７２　ｈ。　１．６分析方法　发酵产物（乙醇、木糖醇）及发酵液中残糖均由高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定。待测发酵液先经　１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，上清液经０．４５　Ｉｘｍ微孔滤膜过滤后进样测定。色谱条件为：柱温６０　ｃｃ，纯净　水作流动相，流速设定为０．５　ｍＬ／ｍｉｎ。　２结果与讨论　２．１　ｐｉｔ值对木糖发酵的影响　以稀ＮａＯＨ和Ｈ　ｓＯ　溶液调节发酵培养基的初始ｐＨ值分别为２．５、３．５、４．５、５．５和６．５，发酵时　间为７２　ｈ。由表１可知，当发酵培养基初始ｐＨ值２．５～６．５范围内变化时，Ｓ．ｃｅｒｅｖ￣ｉａｅ　ＺＵ－１０发酵木糖　乙醇得率的变化很大。初始ｐＨ值的适宜范围为４．５～５．５，最适ｐＨ值为５．５，此时木糖利用率为　９０．５％，发酵液中乙醇质量浓度达到２８．９　ｇ／Ｌ，乙醇得率为３６％，为理论得率的７８．３％（酵母发酵木　糖产乙醇的理论得率为４６％　）。　表１　发酵培养基初始ｐＩ－Ｉ值对木糖发酵的影响　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎ　ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１　０　初始ｐＨ值　２．５　３．５　４．５　５．５　６．５　残留木糖质量浓度／（ｇ・Ｌ－　）　木糖利用率／％　乙醇质量浓度／（ｇ・Ｌ－　）　乙醇得率／％　ｘｙｌｏｓｅ　ｃｏｎｓｕｍｅｄ　４３．４　８５．Ｏ　８９．Ｏ　９０．５　８５．８　占理论值／％　ａｃｃｏｕｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｙｉｅｌｄ　３７．Ｏ　６７．４　７１．７　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｘｙｌｏｓｅ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｎ．４５．３　ｌ２．Ｏ　８．８　７．６　ｌ１．４　ｅｔｈａｎｏｌ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｎ．　ｌ３．４　２４．９　２６．４　２８．９　２４．６　ｅｔｈａｎｏｌ　ｙｉｅｌｄ　ｌ７　３ｌ　３３　３６　３ｌ　７８．３　６７．４　２．２初始木糖质量浓度对木糖发酵的影响　将发酵培养基初始木糖质量浓度分别配制为５０、８０、１２０、１５０　ｇ／Ｌ，控制不同的发酵时间，探讨初始　木糖质量浓度对发酵的影响。从表２可以看出，随着木糖质量浓度的增加，木糖利用率和乙醇得率均逐　渐降低，当木糖质量浓度高于８０　ｇ／Ｌ时，发酵液中残留木糖质量浓度过高，木糖利用率和乙醇得率迅速　下降。可见在Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０发酵木糖的过程中，存在着底物浓度抑制现象。Ｓｃｈｖｅｓｔｅｒ等　有关酵　母的研究发现，当木糖质量浓度从５０　ｇ／Ｌ升至２００　ｇ／Ｌ时，Ｐ．ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ发酵木糖的乙醇产量从　０．３２　ｇ／Ｌ降到０．１４　ｇ／Ｌ，Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅ发酵木糖的乙醇产量从０．４５　ｇ／Ｌ降到０．１３　ｇ／Ｌ。　维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期　王周芳，等：基因重组酵母发酵木糖产酒精的研究　表２初始木糖质量浓度对木糖发酵的影响　Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｘｙｌｏｓｅ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓ．ｃｅｒｅｖ￣ｉａｅ　ＺＵ一１０　３５　２．３接种量对木糖发酵的影响　不同的接种量水平对Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０发酵木糖影响较大（表３）。当接种量（以细胞干质量计，　下同）为０．３　ｇ／Ｌ时，发酵７２　ｈ后残留木糖质量浓度仍高达５６．８　ｇ／Ｌ，木糖利用率仅为２９．０％，乙醇质　量浓度只达到８．７　ｇ／Ｌ。随着接种量的增加，木糖利用率和乙醇得率均迅速增大。当接种量增至　１．８　ｇ／Ｌ时，残留木糖为３．３　ｇｌＬ，９５．９％的木糖被利用，乙醇质量浓度达３０．１　ｇ／Ｌ。可见高密度接种有　利于提高木糖利用速率和乙醇生产速率，但游离细胞发酵不易做到对酵母细胞的重复利用，将细胞固定　化后再进行发酵将是一个很好的解决办法。　表３接种量对木糖发酵的影响　Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｌｅｖｅｌ　ｏｎ　ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０　２．４　乙酸质量分数对木糖发酵的影响　乙酸是植物纤维原料半纤维素水解液中的主要抑制因子　Ｊ，在半纤维素水解过程中由半纤维素脱　乙酰基产生，因此研究基因重组酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖ￣ｉａｅ　ＺＵ一１０对乙酸的耐受性很有必要。从表４可看出，当　发酵液中的乙酸质量分数低＝Ｆ０．０５％时，对Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０发酵木糖的影响不大；乙酸质量分数高　于０．０５％时对木糖发酵产生较大的影响，当乙酸质量分数增至０．２％时，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０对木糖的　发酵基本停止。应用Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０发酵植物纤维水解液生产乙醇，必须解决菌株对乙酸等抑制因　子的耐受性问题，可以从菌种驯化及发酵前对水解液进行脱毒处理（如汽提、石灰中和、活性炭吸附等）　两个途径人手。　表４乙酸质量分数对木糖发酵的影响　Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｍａｓｓ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０　２．５葡萄糖添加量对木糖发酵的影响　以上各因素的考察均以纯木糖为发酵底物，但植物纤维原料水解液中通常是葡萄糖与木糖同时存　在，如碱预处理后的秸秆水解液和氨爆破处理后的甘蔗渣水解液。发酵培养基初始木糖质量浓度被设　定为３０　ｇ／Ｌ，添加不同量的葡萄糖，探讨葡萄糖添加量对Ｓ．ｃｅｒｅｖ￣ｉａｅ　ＺＵ一１０木糖发酵的影响，发酵时间　为３６　ｈ。表５中结果表明，添加一定量的葡萄糖有利于提高木糖利用率，当葡萄糖质量浓度为４０　ｇ／Ｌ　时，３６　ｈ内木糖利用率达８５．７％，高于以木糖为唯一碳源时７９．０％的木糖利用率。葡萄糖和木糖的共　维普资讯 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林产化学与工业　第２７卷　发酵可以更充分地发酵木糖，这一特性对应用Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ－１０发酵植物纤维水解液生产乙醇具有重　要意义。　表５葡萄糖添加量对木糖发酵的影响　Ｔａｂｌｅ　５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｎ　ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０　２．６葡萄糖和木糖共发酵的时间进程　以３０　Ｌ木糖和５０　Ｌ葡萄糖为复合碳源，研究了Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ—　ｓｉａｅ　ＺＵ一１０对葡萄糖和木糖的共发酵的时间进程（见图１）。共发　酵结果表明，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０快速代谢培养基中的葡萄糖，接　种后１２　ｈ内５０　Ｌ葡萄糖便被酵母细胞完全利用，发酵液中乙　醇质量浓度迅速上升到２４．９　ｇ／Ｌ，但木糖代谢速度较慢，在前　１２　ｈ仅有２７．７％被利用。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０代谢葡萄糖速度快　于木糖，是因为木糖的代谢途径比葡萄糖要复杂得多。葡萄糖和　木糖的共发酵过程中也检测到少量的木糖醇存在于发酵液中。　０　１０　２Ｏ　３Ｏ　４０　５０　时间，ｈ　３结论　一一一＿，Ｉ．　卿　口一葡萄糖ｇｌｕｃｏｓｅ；－＊－木糖ｘｙｌｏｓｅ；　一△一木糖醇ｘｙｌｉｔｏｌ；一。一乙醇ｅｔｈａｎｏｌ　３・１　基因重组酵母Ｓ・ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０可以在厌氧条件下发酵木图１　．ｃＰ　ｖ／ｓ／ａＰ　ＺＵ—１０对葡萄糖和木　糖产乙醇，在８０　Ｌ木糖、初始ｐＨ值５．５、接种量（以细胞干质量　糖的共发酵的时间进程　计）１．２　ｇ／Ｌ培养液中３０　ｑＣ厌氧发酵７２　ｈ，木糖利用率达Ｆｉｇ．１　Ｔｉｍ　。　。ｆ　。ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ。　。ｆ　９０．５％，发酵液中乙醇质量浓度达到２８．９　ｇ／Ｌ。　ｇ１ｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｙ１ｏｓｅ　ｂｙ　ｓ。ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　３．２当发酵液中的乙酸质量分数低于０．０５％时，对Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０　ＺＵ一１０发酵木糖的影响不大；乙酸质量分数高于０．０５％时对木糖发酵产生较大的影响，当乙酸质量分　数增至０．２％时，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０对木糖的发酵基本停止。　３．３添加适量的葡萄糖可促进木糖发酵，这一特性对应用Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＺＵ一１０发酵植物纤维原料水解　液生产乙醇具有重要意义。　参考文献：　［１］ＳＵＮ　Ｙ，ＣＨＥＮＧ　Ｊ．Ｈｙｄｏｒｌｙｓｉｓ　ｏｆｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ　ｍａｔｅｉｒａｌｓ　ｆｏｒ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，８３：１—１１．　［２］季更生，勇强，余世袁．不同培养条件对树干毕赤酵母戊糖发酵的影响［Ｊ］．林产与化学工业，２００４，２４（２）：２５—２８．　［３］张潇，朱冬青，王丹，等．粗糙脉孢菌（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）木糖发酵的研究［Ｊ］．微生物学报，２００３，４３（４）：４６６—４７２．　［４］ＺＡＬＤＩＶＡＲ　Ｊ，ＮＩＥＬＳＥＮ　Ｊ，ＯＬＳＳＯＮ　Ｌ．Ｆｕｅｌ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｅ：ａ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ｏｆｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｎｔｅｇｒａ－　ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，５６：１７－３４．　［５］ＭＯＮＩＲＵＺＺＡＭＡＮ　Ｍ，ＤＩＥＮ　Ｂ　Ｓ，ＳＫＯＲＹ　Ｃ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｎ　ｆｉｂｒｅ　ｓｕｇａｒｓ　ｂｙ　ａｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｘｙｌｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｙｅａｓｔ　ｓｔｒａｉｎ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ　Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１３：３４１－３４６．　［６］ＹＵ　Ｓ，ＪＥＰＰＳＳＯＮ　Ｈ，ＨＡＨＮ—ＨＡＧＥＲＤＡＬ　Ｂ．Ｘｙｌｕｌｏｓｅｆｅｍｒｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ａｎｄ　ｘｙｌｏｓｅ—ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ　ｙｅａｓｔ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９５，４４：３１４—３２０．　［７］ＨＡＨＮ－ＡＧＥＲＤＡＬ　Ｂ，ＪＥＰＰＳＳＯＮ　Ｈ，ＳＫＯＯＧ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｙｅａｓｔｓ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９４，１６：９３３－９４３．　［８］ＳＣＨＶＥＳＴＥＲ　Ｐ，ＲＯＢＩＮＳＯＮ　Ｃ　Ｗ，ＭＯＯ　Ｙ　Ｍ．Ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｂｙ　Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ　ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｎａｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　１９８３，１３：１３１－１５２．　［９］ＰＡＬＭＱＶＩＳＴ　Ｅ，ＨＡＨＮ—ＨＡＧＥＲＤＡＬ　Ｂ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ．Ｉ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｔｏｘｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。２ｏｏＯ。７４：１７—２４．